精子DNA损伤是指精子在发育和成熟过程中遗传物质DNA发生的结构或功能缺陷，包括DNA链断裂、碱基变异或丢失，其可能是由于复制误差、自由基攻击、环境毒素或辐射等因素造成。精子DNA在胚胎遗传和发育中极为重要，评估精子DNA损伤程度，对评估男性生育力和辅助生殖技术（assistedreproductive technology，ART） 临床结局具有重要意义。精子DNA碎片指数 （DNA fragmentation index，DFI）是评价精子DNA损伤程度的关键指标，与受精率、妊娠率和流产率密切相关，且存在较多DNA损伤的精液样本常伴随精子运动和形态异常，这可能是影响体外受精（in vitro fertilization，IVF）成功率和早期流产的潜在原因。综述ART中精子DNA损伤的研究现状，探讨其对ART治疗结局的影响，并综合目前实验室常用的精液制备方法评估判断其在降低精子DFI对ART影响方面的有效性，为临床实践和未来研究提供参考。
一、精子DNA损伤类型及常见因素
1. 精子DNA的损伤类型 精子在发育过程中可能会遭受单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）和双链DNA （double -stranded DNA，dsDNA） 损伤 。Talibova等指出，dsDNA损伤的修复对于维持精子遗传物质的稳定性至关重要，修复DNA损伤能力的缺陷可能增加胚胎异常和IVF失败的风险。LaraCerrillo等的研究分析了23例特发性不育男性妻子的妊娠结局，并区分了精子ssDNA和dsDNA损伤的不同影响，结果表明，ssDNA损伤与氧化应激密切相关，可能影响精子的运动能力，最终影响妊娠率；而dsDNA损伤则与流产和低胚胎质量相关，可能对胚胎的发育和着床产生不利影响。Casanovas等将43对夫妇根据精子DNA损伤的类型分为ssDNA损伤组和dsDNA损伤组，再将2组患者根据损伤水平分为低损伤组和高损伤组，发现高dsDNA损伤组的胚胎植入率显著低于低dsDNA损伤组（22% vs. 52%，P＜0.05），且高dsDNA损伤组相比低dsDNA损伤组在第二极体排出、T4、T8、桑椹胚阶段以及早期囊胚上都有显著延迟（P＜0.05），而高ssDNA损伤组和低ssDNA损伤组之间则没有胚胎植入率和胚胎发育动力学参数的差异（均P＞0.05)，这表明dsDNA损伤对胚胎植入有负面影响。
2. 氧化应激可能是导致精子DFI升高的关键因素 过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以使精子发生自身无法修复的DNA断裂，同时进一步损害精子的细胞膜和细胞内蛋白，进而影响精子的获能、顶体反应和受精能力。Patki等的研究将300例年龄在25～45岁之间的不育男性分为抗氧化混合物治疗组（150例）和安慰剂对照组（150例），发现抗氧化混合物治疗组治疗后较治疗前DFI显著下降，而安慰剂对照组治疗前后的DFI无变化，治疗后治疗组DFI较安慰剂组治疗后降低，这表明抗氧化剂治疗在降低DFI方面可能有效。Humaidan等对有IVF-胚胎移植治疗失败史且DFI＞15%的31例不育男性患者进行了3个月生活方式（饮食、运动）干预和抗氧化剂（多种维生素、辅酶Q10、omega-3和微量元素）治疗，发现不育男性组治疗后精子DFI中位数从25.8%降低到18.0%（P＜0.000 1），而10例未进行任何生活方式干预和相关治疗的健康志愿者在与治疗组相同时间点的2次精液检查时的DFI差异无统计学意义（P＞0.05）；对比后发现，不育男性组干预后DFI的降低幅度显著高于健康志愿者在同一实验周期内DFI的变化幅度（7.20% vs. 0.42%，P＜0.000 01）。说明个性化的生活方式和抗氧化干预可以提高低生育力患者的生育能力。
3. DFI的增加可能与男性年龄增长有关 李美玲等对777例男性患者的年龄和相应的精子DFI水平进行分析后发现，随着男性年龄升高，精子DFI水平也升高，男性年龄增长显著影响精子DFI水平（P＝
0.000 2）。Donatti等根据年龄（＜35岁、35～45岁、≥45岁）将2016—2021年间在巴西的单一生殖医学中心接受DFI检测的367例男性分为3组后发现，≥45岁组的DFI显著高于＜35岁组和35～45岁组 （P＜0.05）。可见，随着年龄增长，男性的DFI显著上升，这可能与睾丸、前列腺和附睾等生殖系统器官的老化、ROS的增加以及抗氧化防御能力的下降有关。
4. 男性的激素水平变化可能影响精子DFI Bahrani等研究把60例年龄在25～45岁的少弱畸形精子症（oligoasthenoteratozoospermia，OAT）男性分为4组：正常精子参数且DFI＜19.25%组（15例）、正常精子参数且DFI＞19.25%组（15例）、OAT且DFI＜19.25%组（15例）和OAT且DFI＞19.25%组（15例），发现卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）在OAT的2组与正常精子参数的2组之间都存在显著差异，且都在DFI＞19.25%组中水平更高，具体来说，正常精子参数且DFI＜19.25%组的FSH和LH水平显著低于正常精子参数且 DFI ＞19.25% 组 （P ＜0.01），OAT 且DFI ＜19.25%组的FSH和LH水平也显著低于OAT且DFI＞19.25%组（P＜0.01），且在OAT患者中，这种结果更为明显。同时，正常精子参数且DFI＞19.25%组的抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平显著高于正常精子参数且DFI＜19.25%组，与DFI值呈正相关，而在OAT的2组中无论DFI水平高低，AMH水平整体都较低，并与正常精子参数组间有显著差异（P＜0.05）；此外，催乳素（prolactin，PRL）的水平也与DFI呈正相关（P＜0.05）。因此认为，男性激素水平可能对精子DNA的完整性有一定影响，特别是对于OAT患者，激素水平的变化可能对精子DNA完整性和精液参数的影响更大。
二、精子DFI的检测与新兴相关生物标志物评估精子DNA损伤
1. 常见的DFI检测技术手段 ①DNA完整性末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）检验。TUNEL检验是检测精子DFI最常用的技术。断裂DNA链暴露出的3′-羟基末端，在DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，作为引物与荧光染料或生物素标记的脱氧尿苷酸三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP） 结合来标记断裂位点。②精子染色质分散（sperm chromatin dispersion，SCD）法。SCD法是一种利用光学显微镜观察精子DNA对酸处理敏感性的试验。完整精子DNA在酸变性和核蛋白去除后可扩散形成中心密度向四周递减的特征性光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生这种特征性的光晕。③彗星实验（单细胞凝胶电泳实验）。在电场中，精子DNA链的断裂出现不同的迁移速率。DNA损伤越严重，产生的碎片越多且越小，向阳极迁移的量越大，迁移距离越长，荧光染色后呈现长尾状的“彗星”图案，且荧光强度增加。④吖啶橙流式细胞术。吖啶橙插入dsDNA后可激发绿色荧光，而插入ssDNA时则为红色荧光。借助流式细胞术收集红色和绿色荧光数据，并转化为精子群体中红色荧光的表达度，即DFI。
2. 新兴相关生物标志物 ①鱼精蛋白（protamine，PRM）比例。PRM是一种存在于精子头部的核蛋白，用于精子DNA的正确包裹和维持精子功能，在哺乳动物中，鱼精蛋白主要有PRM1和PRM2两种类型。Amor等根据是否有生育能力，将272例接受IVF/卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗的女性伴侣的精子样本分为生育组（n=151）和亚生育（n=121），研究发现，与生育组相比，亚生育组精子DNA碎片化（sperm DNA fragmentation，SDF）和PRM比例（PRM1/PRM2）显著升高[分别为（12.31±7.01）% vs（. 17.5±9.5）%，P=0.001；（0.91±0.43）vs（. 0.75±0.42），P=0.003）]，且PRM比例与SDF呈正相关（r=0.356，P=0.001），这表明PRM比例可能作为评估精子DNA损伤的其他生物标志物。②平均DNA断点数（mean number of DNA breakpoints，MDB）的评估。有研究收集了93对进行IVF治疗的夫妇，基于精子DFI的临界值，将最终纳入DFI分析的72例分为DFI≤30%的精子DNA完整性正常组（56例）和DFI＞30%的精子DNA完整性受损组（16例）；基于MDB的临界值，将最终纳入MDB分析的93例分为MDB≤0.37 nmol/L的精子DNA完整性正常组（45例）和MDB＞0.37 nmol/L的精子DNA完整性受损组（48例），结果显示，精子MDB与精子前向运动的负相关性（r=-0.43）比DFI与精子前向运动的相关性（r=-0.37）更强，也就是说，MDB与精子前向运动的负相关性更为显著，在IVF结果的比较中，使用MDB分层的DNA完整性受损组的优质胚胎率显著低于DNA完整性正常组（P＜0.01），而以DFI分层的组间IVF结果差异无统计学意义。因此MDB作为评估精子完整性的新方法，可能比传统的DFI更能准确地反映精子DNA的损伤程度。
三、DFI对ART结局的影响
DFI可能影响精子受精能力、胚胎质量及胚胎发育潜能，最终影响着床和妊娠结局。作为评估精子质量及预测ART成功率的新指标，关于DFI与IVF/ICSI成功率的关系尚存在争议，这可能与不同研究
的研究设计、样本量、检测方法和患者特征等有关。
1. DFI对常规精液参数的影响 李美玲等将777例患者根据DFI（＜15%、15%～30%、≥30%） 分为3组，发现精子DFI与精子总活力呈负相关。Chua等将2 564名在澳大利亚珀斯医疗中心进行精液测试的男性按DFI分为＜5%、5.1%～10%、10.1%～15%、15.1%～29.9%和≥30% 5组，发现DFI与男性年龄、禁欲时间和精液体积呈正相关，与正常形态百分比、前向运动性和精液pH值呈负相关。舒慧泉等回顾性分析行IVF且男方接受精子DFI检测的378对夫妇的临床资料后发现，精子DFI与前向运动精子百分比、正常形态精子百分比呈负相关（均P＜0.001）。杜文婷等将接受男性精液检查的患者根据DFI分为＜15%组（178例）、15%～30%组（155例）和＞30%组（142例），发现DFI与正常形态精子百分比呈负相关。综上可以认为，精子DFI的升高可能导致精子活力下降和形态常。
2. DFI对IVF受精率的影响 Zhang等将179例因女性输卵管因素接受IVF治疗的配偶（男性患者）根据精子DFI结果分为低DFI组（DFI≤15%，137例）和高DFI组（DFI≥30%，42例），发现高DFI组受精率显著低于低DFI组（75.9% vs. 81.0%，P＝0.011）。一项对IVF受精失败后行补救性ICSI的140对不孕不育症夫妇的回顾性研究结果显示，在完全受精失败（totalfertilization failure，所有的卵子都没有发生受精）组患者中，DFI对补救性ICSI的受精率和正常受精率无显著影响；然而，在部分受精失败（partial fertilization failure，部分卵子发生了受精）组患者中，DFI＜30%组较DFI≥30%组有更高的受精率，即在常规IVF部分受精失败的情况下，精子DFI影响IVF受精失败后行补救性ICSI的受精率和正常受精率。另一项对1 339对接受2 759个IVF/ICSI周期治疗夫妇的研究
发现，高DFI组（DFI≥15%）与低DFI组（DFI＜15%）之间受精率无差异。综上，尽管不同研究的分组方法或ART治疗方案不同可能导致结论不一致，但精子DFI对男性受精率的影响仍是不容忽视的。
3. DFI对胚胎质量及妊娠结局的影响 研究表明，精子DFI可能通过影响胚胎植入后阶段的囊胚质量来影响妊娠结局。一项对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 患者的研究将接
受IVF治疗的473对不孕不育夫妇分为PCOS组（141例）和对照组（332例），每组根据DFI进一步分为DFI≤15%组和DFI＞15%组，发现DFI水平对对照组患者IVF结果没有影响，而PCOS组患者使用DFI＞15%的精子进行IVF治疗虽不影响受精率、临床妊娠率和流产率，但显著降低了优质囊胚形成率（P＜0.05）。Okubo等将182例主诉为不育症的男性患者根据精子DFI分为低（≤15%）、中（15%～30%）和高（≥30%）3组后也发现，高DFI组男性IVF的囊胚发育率显著降低，多变量分析显示，高DFI与低优质囊胚形成率显著相关（P＜0.05）。Donatti等将255例进行IVF治疗的男性患者按年龄分为年轻组（＜35岁）、中间年龄组（35～45岁）和较年长组（≥45岁），发现各年龄组之间的受精率并无显著差异，但高质量囊胚形成率在较年长组中呈现下降趋势。然而，Hervás等
研究发现，高DFI组（DFI≥15%）与低DFI组（DFI＜15%）IVF/ICSI的临床妊娠率、流产率和累积活产率差异均无统计学意义。杨洪毅等回顾性分析了接受夫精宫腔内人工授精（artificial insemination with husband′s sperm-intrauterine insemination，AIHIUI）治疗的不孕不育夫妇的1 185个周期后发现，低DFI组（DFI＜15%）和高DFI组（DFI≥15%）ICSI助孕周期的临床妊娠率、生化妊娠率没有显著差异。
在探讨精子DNA损伤对ART后代安全性的研究中，Li等将6 330对夫妇分为IVF组和ICSI组，并在各组中根据DFI分为3个亚组：DFI＜15%组、DFI15%～30%组以及DFI＞30%组。结果表明，不论IVF组还是ICSI组，DFI＞30%组和DFI 15%～30%组的流产率均显著高于DFI＜15%组。此外，与DFI＜15%组相比，DFI＞30%组和DFI 15%～30%组的新生儿出生体质量显著降低，而死产率、早产率和出生缺陷率无显著差异。
精子中受损的DNA可能对胚胎的正常发育造成干扰，从而增加流产风险。Ping等对119对不明原因反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）夫妇的研究发现，DFI的升高与胚胎非整倍体率的升高及早期流产率的增加有关。范烺等对322例因女方输卵管因素接受IVF助孕的不育男性根据高DNA可染色性（high DNA stainability，HDS）值分为5组：0%～＜5%、5%～＜10%、10%～＜15%、15%～＜20%和≥20%，发现当HDS＞10%时，早期流产率显著升高。杨洪毅等对1 185个AIH-IUI周期的不孕不育夫妇的妊娠结局与DFI的关系研究指出，低DFI组的早期流产率显著低于高DFI组（P＜0.05），高DFI水平（DFI≥15%）与早期流产风险的增加显著相关。
4. 卵母细胞对精子DNA损伤修复能力影响ART成功率 卵母细胞能够通过激活DNA修复基因和利用母体储备的修复蛋白来应对精子的DNA损伤，这些机制在维持基因组稳定性和胚胎正常发育中发挥
着关键作用。然而，卵母细胞的这种修复能力可能会受到多种因素的影响。
有研究发现，超重女性的卵母细胞对精子DNA的修复能力下降，可能会对胚胎的早期发育产生不利影响；而在正常体质量的女性中，即使DFI较高，卵母细胞仍能保持较好的修复能力和胚胎发育潜力。
女性年龄的增加可能会降低卵母细胞的DNA修复能力。Fu等对495对流产夫妇的研究发现，高龄女性（≥35岁）使用高DFI的精子进行IVF或ICSI治疗时，SDF的升高与流产胚胎的染色体非整倍体率增加显著相关。受试者工作特征曲线显示，SDF可以有效预测高龄女性在接受新鲜胚胎移植周期时流产胚胎染色体异常的风险。具体而言，当SDF水平达到或超过8.5%时，流产及染色体非整倍体的风险增加5.76倍（OR=6.76，95%CI：1.20~37.99）。Horta等在小鼠模型中得出相似结论，老年母鼠的受精卵和早期胚胎中DNA损伤反应和修复基因表达减少，同时囊胚形成率下降，最终影响胚胎发育。
此外，激素的减少也可能影响卵母细胞的修复能力。有研究发现，女性血清AMH水平与IVF成功率有关，特别是在AMH水平低于12 pmol/L时，精子DFI的增加会显著降低获得优质胚胎的概率，而当AMH水平在14.28～48.55 pmol/L这一范围内时，DFI的升高对IVF成功率的影响不显著。
四、ART中降低精子DFI的精液制备方法
1. 密度梯度离心（density gradient centrifugation，DGC）结合上游法（upstream，SU） Dai等通过对529个IVF周期的夫妇进行分析，根据精液质量分为正常组（306个IVF周期，使用DGC/SU方法处理正常精液样本）和观察组[223个IVF周期，使用双密度梯度离心（double density gradient centrifugation，DDGC）/SU方法处理质量较差的精液样本，包括液化缺陷、含有太多无法解决的凝块或精子数量稀少等标本，结果发现，虽然观察组的DFI显著高于正常组（P＜0.000 1），且2组间的正常受精率、优质D3胚胎形成率等指标存在显著差异，但在临床结局方面，2组的妊娠率、自然流产率、着床率和活产率等无显著差异，这两种方法的结合在一定程度上可以显著降低精子DFI和畸形率对IVF临床结局的影响。另有研究发现不同的密度离心法对精液处理的效果也存在差异，在少精子症患者中，密度小梯度离心（minigradient）和单层90%密度梯度离心均能显著降低精子DFI，而单层45%密度梯度离心降低精子DFI的效果劣于上述两种方法。
2. 磁激活细胞分选 （magnetic -activated cellsorting，MACS） 技术 有研究发现MACS与睾丸精子抽吸（testicular sperm aspiration，TESA）技术在高DF（I DFI＞30%）的精子IVF中的活产率相当，都能有效提高ART成功率。另一项纳入150对夫妇（男方DFI均≥30%）的随机对照试验也发现，MACS技术可能改善精子DNA损伤对妊娠结局的不利影响，具体来说，与对照组相比，MACS组在首次胚胎移植周期的活产率以及整个治疗周期的累积活产率上均有提升的趋势，同时在移植过程中所需的胚胎数量和移植次数也显著减少。
3. 流变性选择技术 Romero-Aguirregomezcorta等提出了一种通过使用微流体模拟精子在体内自然流动的流变性选择技术，最终筛选出具有较高活力、良好形态和较低DFI的精子；通过使用10只雄性小鼠和944个卵母细胞进行ICSI实验，其中，使用流变选择技术的精子作为实验组，而使用SU法选择的精子作为对照组，研究发现实验组的精子具有更高的受精率、着床率和胎儿发育率（均P＜0.05）。
4. 双管法 双管法是利用精子的活力和运动力来实现筛选的一种新兴的精液制备方法，使正常精子游至B管，而非精子成分留于A管来进行筛选。Shi等将31对进行IVF治疗的不孕不育夫妇进行随机
分组，比较了SU法（15例）与双管法（16例）在治疗中的效果，与SU法相比，双管法显著提高了精子活力和精子正常形态百分比，并且显著降低了精液和精子中抗精子抗体（anti sperm antibodies，ASAs）的水平。尽管2组的临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05），但双管法组的流产率显著低于SU组 （P＜0.05）。然而，目前关于双管法的研究样本量小，可能存在一定的局限性。
5. 其他精液制备过程中可能影响精子DFI水平的因素 ①体外孵育时间。Karimi等研究表明，在室温或37 ℃的条件下，即使是短时间的体外孵育，也可能导致精子活力下降和SDF程度加剧。②冷冻保
存后的精子处理。冷冻保存后的精子给予线粒体激活剂可以减少损伤。研究表明，冷冻过程可能会增加SDF、氧化损伤以及ROS水平，而O-[3-哌啶基-2-羟基-1-丙基]-烟酰胺氧化物（O-[3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl]-nicotinic amidoxime，BGP-15）的应用在冷冻过程中能够显著降低精子DNA的损伤，最终可能改善ART的结局。③通过手术从睾丸获取精子。Esteves等将963对进行ICSI的夫妇分为使用手术获取的睾丸精子和使用射出的精子2组进行前瞻性队列研究，发现使用睾丸精子组的临床妊娠率和活产率显著高于使用射出精子组（均P＜0.05）。这可能是由于手术避免了附睾中氧化应激导致的DNA损伤，提高了临床妊娠率，同时也减少了早期流产的风险，从而改善受精率和胚胎质量。④使用ICSI技术可能消除精子DNA损伤的不利影响。ICSI的处理过程可能会排除一些DNA受损的精子，从而使DFI并不显著影响ICSI的结果。一项前瞻性研究观察到，在ICSI过程中，尽管SDF与精子的活力和浓度存在负相关性，但ICSI技术可能能够抵消SDF对受精和胚胎发育产生的不利影响，从而使SDF水平与胚胎学或临床结果无显著关联。Blachman-Braun等将550对共进行了1 050个ICSI周期的夫妇按是否成功妊娠分为成功妊娠组与未成功妊娠组，结果提示2组间DFI和HDS无显著差异，也证实了DFI和HDS水平可能不会影响夫妇接受ICSI后的妊娠成功率。
五、结语
目前，在精子DNA损伤对ART成功率影响的研究中，大多数研究基于小样本，并且分别着眼于影响精子DFI的不同因素，使得精子DNA损伤对ART各个阶段的影响仍存在争议，因此评估精子质量对ART结局的影响时，需综合考虑包括年龄、精液参数和治疗策略在内的多种因素。精子DFI是目前临床评估精子DNA完整性的一个重要指标，临床实践中，应根据患者具体情况选择最合适的精子制备方法。降低精子DFI的精子处理方法可能为解决男性因素导致的ART失败提供新的治疗策略，这需要通过大规模、多中心的随机对照试验来验证，包括对技术的长期效果、安全性的评估，以及对不同患者群体的技术适用性研究。治疗上应更加重视个性化治疗策略，并探索新的技术以优化精子的选择，进而提升ART的成功率。
备注：以上内容出自 国际生殖健康 / 计划生育杂志 相关内容
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