人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)为双链环状DNA 病毒,具有高度特异性,通常附着于人表皮及黏膜鳞状上皮,HPV 通常会攻击女性生殖 道,引起多种妇科疾病。HPV 存在十几种不同 的亚型,主要分为低危型及高危型,前者如 HPV6、 HPV11型等,通常导致尖锐湿疣,后者如 HPV16、 HPV18型 等,易 导 致 宫 颈 癌 变,引 发 宫 颈 癌、外 阴 癌。随着我国育龄期女性HPV感染率增加及生 育政策的调整,HPV 感染是否对妊娠结局产生影响 引起临床医师广泛关注。辅助生殖(assistedreproductivetechnology,ART)是临床上助 孕的常用方式,有学者提出HPV感染可能对不孕症患者的ART助孕结 局产 生一 定的影响。 研 究 表 明, HPV 感染的患者可能会引起早期流产,尤其是高危HPV感染会增加患者不良妊娠结局。但目前关于感染 HPV不同亚型对不孕女性阴道微生态及ART助孕结局的影响是否存在差异的研究较少。 本研究通过对感染HPV不同亚型的患者进行分析, 探究其对不孕女性阴道微生态及ART助孕结局的影响,以期为改善 HPV 感染不孕患者的妊娠结局提供参考依据。
1.研究对象与方法
1.1研究对象
选取2020年1月至2022年3月期间在宝鸡市 中心医院进行 ART 助孕的 HPV 阳性不孕女性190 例,根据患者感染 HPV 的不同亚型将其分为高危组 (151例)(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等高危 分型)与 低 危 组 (39 例)(HPV6、HPV11、HPV33、 HPV35等低危分型);选取同期进行 ART 助 孕 的 HPV 阴性不孕女性纳入对照组(95例)。
纳入标准:
①未避孕情况下不孕年限≥1年的不孕症女性;
②对患者均进行 HPV 筛查；
③年龄为20~ 40岁；
④患者均符合体外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryotransfer,IVF-ET)适 应 症 并 接 受治疗;
⑤患者均有生育意愿;⑥患者均签署知情同意书。
排除标准:
①夫方不育者;
②患有内分泌疾病者；
③习惯性流产者;
④ 近期进行过阴道药物治疗者;
⑤ 患有凝血功能障碍 者;
⑥ 患有恶性肿瘤者;
⑦治疗依从性较差者;
⑧患有其感染性疾病者;
⑨患有精神类疾病者。
本研究已经通过宝鸡市中心医院医学伦理委员会批准(批号:BZYL2019-10)。
1.2方法
1.2.1HPV 的筛查
患者取截石位,将窥阴镜缓慢置入患者阴道内, 暴露宫颈后,用无菌棉签清洁宫颈口处分泌物(注意勿用力摩擦),若患者宫颈口分泌物较多,可采用卵 圆钳进行辅助清理宫颈口分泌物。将宫颈刷深入宫颈管,顺时针旋转3~5圈,缓慢取出后置于样本瓶 (含有宫颈细胞保存液)中,折断瓶外宫颈刷柄,密封 保存。采用荧光 PCR 及 DNA 探针杂交技术检 测 HPV亚型:提取宫颈细胞的总DNA,并通过倒流杂 交的原理,将PCR产物与固定在基因芯片膜上的DNA探针进行杂交、显色,根据 HPV 薄膜条带上的分布情况判定HPV亚型。
1.2.2IVF-ET 的治疗过程
患者接受常规检查后,于月经周期第21天皮下 注射短效促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasinghormoneagonist,GnRH-a),醋酸曲普瑞林 (批准文号:H20100365,规格:1mL∶0.1mg)0.1mg/d, 并于下次月经周期的第3天检查患者激素及卵泡大 小,判断是否启动促性腺激素(gonadotropin,Gn), Gn启 动 后 给 予 注 射 用 尿 促 卵 泡 素 (国 药 准 字: H20052130,规格:75IU),肌肉注射150~225IU,同 时将醋酸曲普瑞林剂量调整为0.05mg/d。当 B 超 显示子宫内有1个优势卵泡直径≥18mm 和/或血浆 雌二醇水平达300~900pg/mL时,已达到排卵前状 态,此时注射人绒毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotropin,hCG)5000~10000IU,注射36h后在 阴道超声的辅助下进行取卵,获得的卵泡培养2h,取 患者配偶的精子,采用含透明质酸酶的缓冲液冲洗, 除去颗粒细胞后继续培养2h。在注射 hCG 后38~ 39h进行受精,受精5h后拆卵、加精,观察到双极核后,于新鲜培养基中继续培养,3d后进行胚胎移植。
1.3观察指标
1.3.1阴道微生态情况的检查
患者入院时进行阴道微生态检查。患者取截石 位,将窥阴镜缓慢置入患者阴道,暴露宫颈后用无菌 棉签于阴道侧壁穹隆处进行取样,并置于无菌试管 中待测。采用阴道微生态检测仪及其配套试剂盒进行测定(江苏硕士生物有限公司),包括乳酸杆菌、唾 液酸苷酶、过氧化氢 (H2O2)及 白 细 胞 酯 酶 的 表 达 情况。
检测结果的判定标准[9]:
①乳酸杆菌:阴性呈红色或紫红色,阳性呈淡黄 色或无色;②唾液酸苷酶:阴性呈红色,阳性呈紫色; ③H2O2浓度:<2mol/L为阴性,≥2moL/L为阳性; ④白细胞酯酶:阴性呈蓝色,阳性呈绿色。4项中出 现1项阳性即判定为阴道微生态失衡,4项均为阴性 则判定为阴道微生态正常。
1.3.2阴道病原菌感染情况的检测
取部分阴道分泌物,于显微镜下观察外阴阴道 假丝酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis,VVC)芽孢 及菌丝;取部分阴道分泌物,加入1~2滴氢氧化钾 溶液(浓度10%),若出现胺臭味则表明为细菌性阴 道 病 (bacterialvaginosis,BV)阳 性。 同 时 感 染 VVC、BV、沙眼衣原体等2种及以上的阴道病原菌 患者为混合型阴道感染。
1.3.3ART 助孕的相关指标
收集患者经 ART 治疗后的获卵数、可移植胚胎 数及优质胚胎数指标。
获卵数:hCG 注射36h后,于阴道获取的卵子数 量;可移植胚胎数:胚胎形态为Ⅰ~Ⅲ级,受精后第3 天,胚胎卵裂球数≥6个;优质胚胎数:胚胎形态为Ⅰ 级、Ⅱ级,受精后第3天,胚胎卵裂球数≥6个。
1.3.4妊娠结局的相关指标
统计患者临床妊娠、活产分娩及流产情况。 临床妊娠:胚胎移植2周后,B超能观察到子宫 内有≥1个孕囊;临床妊娠率=临床妊娠例数/移植 例数;活产分娩率=活产儿分娩数/移植例数;流产 率=流产例数/临床妊娠例数
1.4统计学方法
应用SPSS22.0统计学软件分析数据,符合正态 分布的计量资料以均数±标准差(x - ±s)表示,多组 间比较采用方差分析,两两比较行t检验;非正态分 布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M (P25, P75)]表示,行 Mann-WhitneyU 检验;计数资料以例 数(百分 率)[n(%)]表 示,组 间 比 较 行χ2 检 验,以 P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1三组患者临床资料的对比
三组患者的年龄、不孕年限、孕次、产次、体质量 指数(bodymassindex,BMI),以及不孕原因的分布 比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1
2.2三组患者阴道微生态情况的对比
高危组、低危组、对照组的 H2O2 阳性率比较差 异无统计学意义(P>0.05),高危组、低危组、对照组 的乳酸杆菌、唾液酸苷酶、白细胞酯酶的阳性率及阴道微生态失衡率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 进一步两两比较显示:高危组与低危组的乳酸杆菌、 唾液酸苷酶、白细胞酯酶的阳性率及阴道微生态失 衡率比较差异均无统计学意义(P>0.05);高危组的 乳酸杆菌、唾液酸苷酶、白细胞酯酶的阳性率及阴道 微生态失衡率均明显高于对照组,经比较差异均有 统计学意义(P<0.05);低危组与对照组的乳酸杆 菌、唾液酸苷酶、白细胞酯酶阳性率及阴道微生态失 衡率比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表2
2.3三组患者阴道病原菌感染情况的对比
高危组、低危组、对照组的 VVC、BV 的感染率 比较差异均无统计学意义(P>0.05),高危组、低危 组、对照组的混合型阴道感染率比较差异有统计学 意义(P<0.05)。进一步两两比较显示:高危组的混 合型阴道感染率均明显高于低危组和对照组,经比 较差异均有统计学意义(P<0.05);低危组与对照组 的混合型阴道感染率比较差异无统计学意义(P> 0.05),见表3。
2.4三组患者 ART 相关指标的对比
高危组、低危组、对照组患者的获卵数、可移植胚胎数及优质胚胎数比较差异均无统计学意义（P>0.05),见表4。
2.5三组患者妊娠结局的对比
高危组、低危组、对照组患者的临床妊娠率比较 差异无统计学意义(P>0.05),三组的活产分娩率和 流产率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。进一 步两两比较显示:高危组与低危组的活产分娩率和 流产率比较差异均无统计学意义(P>0.05);高危组 的活产分娩率明显低于对照组,流产率明显高于对 照组,经比较差异均有统计学意义(P<0.05);低危 组与对照组的活产分娩率和流产率比较差异均无统 计学意义(P>0.05),见表5。
3讨论
女性阴道微生态失衡是导致多种妇科病发生的 重要因素,有研究认为阴道微生态紊乱会增加妊娠 不良结局的风险。因此,分析阴道微生态状况 对于了解妊娠结局意义重大。有研究证实,HPV 感 染能够引发产妇阴道微生态失调,增加胎儿早产、绒 毛膜羊膜炎等不良妊娠结局的发生风险。随着 ART 技术的发展,越来越多的学者关注 HPV 患者 与 ART 助孕结局的关系,目前针对二者关系存在一 定争 议[12]。随 着 HPV 感 染 率 不 断 升 高,临 床 对 HPV 亚型的研究越来越重视,目前关于不同 HPV 感染亚型与妊娠结局的相关研究较少,本研究旨在 分析高危型、低危型 HPV 对阴道微生态及 ART 助 孕结局的影响,以提高 ART 妊娠率。
3.1HPV 感染患者阴道微生态紊乱的分析
本研究显示,高危组的乳酸杆菌、唾液酸苷酶、白细胞酯酶的阳性率均明显高于对照组,经比较差异均有统计学意义,高危组与低危组阴道微生态的阳性率比较差异均无统计学意义;三组的 H2O2阳性率比较差异无统计学意义。本研究进一步分析阴道致病菌的感染情况,结果显示,高危组混合型阴道感染率均明显高于低危组和对照组,经比较差异均有统计学意义;三组的VVC、BV 的感染率比较差异均无统计学意义。上述结果提示,高危 HPV 感染导致阴道微生态平衡紊乱,混合型阴道感染的发生率显著增加。分析原因为,生理状态下,乳酸杆菌是阴道内的优势菌,能够将阴道内的糖原转化为乳酸,从而降低并维持阴道内的酸碱平衡,同时乳酸杆菌还能够分泌 H2O2、细菌素等物质抵御病原菌的入侵,降低阴道感染的风险。唾液酸苷酶是由阴道中的一些厌氧菌分泌产生的一种酶。当乳酸杆菌减少时,H2O2的分泌也随之减少,厌氧菌增加,阴道 pH值升高,唾液酸苷酶增多,导致阴道微生态失衡。白细胞酯酶阳性提示阴内存在中性粒细胞,表明阴道存在一定的炎症。当患者阴道微生态平衡被打破,阴道防御病原菌的能力下降,HPV 的易感性增加,而感染 HPV 后,阴道内部免疫功能被破坏,机体抗氧化酶系统紊乱,导致阴道上皮细胞DNA 受损,加重了阴道黏膜的损伤,进一步破坏阴道微生态,从而引起阴道感染性疾病,如 VVC、BV 等
3.2HPV 感染患者 ART 妊娠结局的分析
本研究显示,三组患者获卵数、可移植胚胎数及 优质胚胎数比较差异均无统计学意义,提示 HPV 感 染及不同亚型的 HPV 均未影响 ART 的排卵及受 精过程。本研究对三组患者的临床妊娠率、活产分 娩率及流产率进行比较,结果显示,高危组的活产分 娩率明显低于对照组,而流产率明显高于对照组,提 示高危 HPV 感染会影响患者妊娠及分娩情况。有 研究显示,E-钙黏素的异常表达与复发性流产有 关[15]。当 HPV 感染滋养层细胞后,会导致 E-钙 黏素的异常表达,胎盘入侵子宫壁的能力受到影响, 从而导致早产、流产等不良妊娠结局,影响活产分娩 率[16-18]。本研究显示,HPV 感染,尤其是高危 HPV 感染会影响妊娠结局。高危型与低危型 HPV 感染 对临床妊娠率、活产分娩率及流产率的影响差异不 明显,但高危型 HPV 患者的流产率较低危型 HPV 患者有所提高,这可能是受到了样本量限制的影响, 临床仍需对高危型 HPV 患者的流产风险进行评估, 以降低流产率,改善妊娠结局。
综上所述,不同 HPV 感染亚型对不孕患者阴道 微生态、ART 相关指标、临床妊娠率及活产分娩率 的影响较小,但高危 HPV 感染会增加不孕患者混合型阴道感染的风险。
