胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetictesting,PGT)包括非整倍体PGT(PGTfor aneuploidies,PGT-A)、单基因病PGT(PGT for monogenic/single genedefects,PGT-M)和染色体结构重排PGT(PGT forchromosomal structural rearrangements,PGT-SR),检测取材主要是以胚胎活检的方式，近年也有报道采用无创或微创的方式收集胚胎培养液或者囊胚腔液(blastocoelfluid,BF)作为标本，进行非侵入性PGT或胚胎优选，无论对植入前的胚胎进行何种检测，获取可靠的标本是检测成功实施的首要条件。以下将对胚胎植入前检测标本的获取方法、操作流程及注意事项做一概述。
1胚胎植入前检测标本的获取方法
1.1以活检的方式获取胚胎检测标本
1.1.1活检方法 活检是胚胎植入前检测获取遗传物质的主要方法，包括极体活检、卵裂期胚胎活检和囊胚活检。
极体活检是分别从受精前(D0)的卵母细胞和D1受精卵中依次取出第一和第二极体，或者从D1受精卵同时取出第一和第二极体，可以反映母源性减数分裂错误导致的非整倍体或母源致病变异，单独的极体活检较少应用于PGT;卵裂期活检是在D3进行，建议取单个卵裂球(一般不鼓励取两个细胞),曾是应用最广泛的胚胎活检方式，但其临床应用现已减少；囊胚滋养外胚层(trophectoderm,TE)细胞活检目前已经成为胚胎活检的主要方法²。TE细胞活检在囊胚期取5~10个细胞进行遗传学检测，TE细胞后期发育成绒毛和胎盘，活检对胚胎发育和种植潜能影响较小，而且可用于诊断的细胞数量较多，一定程度上提高了诊断准确性，但由于胚胎嵌合现象的存在³],TE细胞单次活检的可靠性和准确性受到一定影响。在多数情况下，TE细胞的遗传物质可以代表内细胞团(inner cell mass,ICM),然而嵌合TE细胞的活检可能将正常ICM的胚胎诊断为异常，从而浪费了可用胚胎4。
在胚胎TE嵌合现象影响检测结果和对PGT-A运用存在争议的情况下，近年发表的一项关于采用极体活检在高龄女性PGT-A周期多中心RCT研究提出了极体活检在高龄女性PGT-A的运用思考[³]。该研究指出，采用极体活检的PGT-A周期活产率与对照组差异无统计学意义，但流产率较低，因此可能适用于诊断在女方高龄导致胚胎非整倍体的胚胎筛选，但由于极体活检对实验室的操作要求高及现有研究样本量的不足，其运用价值还有待进一步观察。另外，有关第4天桑葚期的胚胎活检，技术上类似于卵裂期活检，可获得与囊胚活检相同数量的细胞，但目前运用较少，在临床广泛实施之前仍需要更多的证据。
1.1.2胚胎活检操作的流程
胚胎活检无论采用何种取材方式，操作都包括：透明带开孔、去除极体/胚胎细胞和标本处理。下面以TE细胞活检为例，简述操作流程：
(1)透明带开孔。通过机械、化学或使用激光进行透明带开孔，其中激光法是目前透明带开孔的主要方法。有关透明带开孔的时机，主要有以下几种：①在授精后第3-4天进行，并在授精后第5~7天取出TE细胞。②在囊胚完全扩张当天同时进行透明带开孔和TE细胞取出。③在囊胚形成当天的早期进行，然后进行几个小时的培养，使TE细胞孵出后进行活检。如下图1[6。
(2)胚胎细胞的取出和样本转管。通过活检管抽吸细胞是使用最广泛的方法，适用于活检的所有方法(极体、卵裂期和TE活检)。在囊胚活检过程中，细胞活检的方式包括：吸出部分细胞后，从胚胎中拉出或者使用激光切割，抽吸结合TE细胞的机械分离6。一般建议活检5~10个TE细胞进行检测(根据囊胚发育阶段和TE细胞数量),活检超过10个TE细胞对胚胎发育的影响目前还不明确。操作过程中，注意吸力均匀轻柔，且避免吸到ICM,正确恰当地使用激光，切割部位设置在细胞之间的连接处，以最大程度减少细胞损伤，同时通过活检管对保持管的快速轻弹运动以机械方式分离TE细胞。为避免活检过程中的交叉沾染，建议为每个活检更换活检吸管或者彻底冲洗活检管，活检后的胚胎单滴培养，细胞单独放置，且要采取严格措施避免活检后胚胎的混淆。活检细胞的编号与冷冻胚胎编号要严格对应。
样本收集和转管过程中，注意采取措施，避免外源性DNA的污染(详见后文注意事项),活检胚胎的编号与标本管要标记清晰，且严格一一对应。在细胞转移到反应管中之前，应使用无菌移液管将活检细胞在缓冲液中至少清洗两次，活检细胞转移到裂解管中的液体量应该控制到最小体积，建议每个胚胎使用新的转移管，注意按照采样批次设置阴性对照6。活检后在显微镜下检查有无细胞滞留，必要时重新转管或者重新活检。活检后的囊胚建议尽快玻璃化冷冻保存，活检与冷冻时间建议间隔在30 min内，超过90 min可能导致囊胚再次膨胀而影响冷冻效果7]。
1.2以胚胎培养液作为检测标本
胚胎培养液虽然可作为胚胎遗传学检测的标本，但其准确性和有效性还有待验证，但随着近年来应用研究的报道增多，此类样本收集和送检操作流程也受到胚胎实验室的关注。
胚胎培养过程中，特别是形成桑葚胚后，随着胚胎细胞数量增多，胚胎在生长过程中会释放游离DNA(circulating free DNA,cfDNA),在使用后的胚胎培养液中(spent blastocyst medium,SBM)可以收集到。此外，BF也被认为是cfDNA的主要来源。有报道对培养液的cfDNA进行检测，从而推断胚胎染色体倍性等信息，但收样方法尚需优化⁸9,还可以通过检测胚胎培养液的代谢、蛋白及线粒体拷贝数等来推测胚胎的植入潜能。由于SBM中的cfDNA检测是否代表胚胎遗传信息目前尚不确定，其在临床的应用价值也尚在研究中。BF中cfDNA被报道为可以与PGT-A一起用作植入前胚胎质量的评估指标10。同时收集BF+SBM的方式是在囊胚冷冻前，通过移液管穿刺囊胚/激光开孔的方式，将BF释放在培养液滴中一起收集¹-2。
对植入前胚胎培养液的检测，受精方式可以为体外受精(in vitro fertilization,IVF)或者卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)¹³,需要注意的是避免精子和颗粒细胞的干扰，特别是IVF的培养体系。在收集培养液检测的过程中，严格遵循相应流程进行，简要介绍如下：
(1)去除颗粒细胞：D0/DI去颗粒细胞操作时尽可能去除颗粒细胞，并进行清洗，D3换序贯培养液前需再次去除颗粒细胞和清洗。(2)清洗和换液，并注意冷冻时机的把握。尽可能地延长D4清洗换液与收集标本之间的间隔，使胚胎冷冻前富集更多的cfDNA;注意囊胚培养皿需要置对照孔，对照孔不用于清洗和放置胚胎。每个胚胎清洗需更换新吸管。(3)吸取样本送检，注意标记送检管与胚胎一一对应，采取措施避免外源性DNA的沾染。胚胎移除后应立即收集培养液，采用一次性无DNA和DNA酶的移液枪尖分别吸取培养液，轻轻混匀，放入冷冻盒内立即冷冻。根据不同检测体系，一般收集体积为10μL~25μL。培养液标本放置于-20℃保存，超过1周建议放置于-80℃保存
2胚胎植入前检测标本获取的注意事项
胚胎送检标本，由于样本的特殊性，无论是活检的胚胎细胞还是无细胞的培养液标本，需要注意的是来源可靠，并能够代表胚胎的信息，标本与胚胎编号需严格对应，收集样本的准备和操作过程中注意尽最大可能降低误诊风险。
2.1实验室准备
胚胎遗传学检测基本以扩增微量DNA为基础，如果受到实验者和实验场地的外源性DNA污染，会影响扩增结果。因此，在活检前，工作台面、设备和耗材应使用经证实适用于IVF实验室的消毒剂进行清洁和去除DNA污染。如有条件，宜单独设置样本收集室。
在PGT相关操作流程中，应穿戴防护服、头套/帽子、面罩(遮住口鼻),穿鞋套或专用鞋，佩戴无粉手套，所有使用的塑料器皿，包括移液枪尖，都应经过无DNA和无DNase认证。避免对采样试剂反复冻融。样本转管和收集过程中，需要迅速，并注意避免枪尖接触管外其他部位。操作者的操作技巧、熟练程度和样本接触耗材的低吸附性均是影响因素。在收集BF或者胚胎培养液作为检测样本的情况下，则要格外注意环境和外源性DNA污染的问题。对实验室设备定期校准、维护，制定书面标准操作
程序和操作指引。关键设备需配备不间断电源。活检、转管和收集样本人员都需要经过专业培训，具备资质后经授权进行操作，IVF和PGT实验室使用的试剂和耗材需经过严格质控并记录批次可溯源。定期总结实验室的各项质控数据并记录，建立标准操作程序和严格质控
体系[145。
2.2注意标本的标识和核对
在胚胎培养、活检、冷冻和解冻过程中，需要进行全程风险管理和质量控制15-16],严格双人核对和及时记录。每个取样后胚胎必须单独培养、冷冻，并且样品管全程具有唯一且清晰编号，与胚胎一一对应，避免由于胚胎编号错误等因素导致样本混淆从而造成误诊的风险。
2.3体外受精-胚胎培养过程及操作细节
对植入前胚胎检测需要稳定的实验室培养环境，如温度、渗透压、pH值等胚胎培养环境的变化，会影响卵母细胞纺锤体，可能影响胚胎的利用率和囊胚形成率，也可能造成胚胎非整倍体率和嵌合体率增加。
胚胎活检一般推荐使用ICSI技术进行授精，以降低精子及颗粒细胞的污染影响检测结果。近年来，有研究初步探索IVF作为受精方式进行PGT-A¹7,但目前仅局限于小样本的研究，其临床运用尚需要更多数据。
另外，实验室流程设置对检测及之后的妊娠结局有一定影响：由于囊胚发育速度不一致，需要操作者在不同的时间段分别活检发育速度快和慢的胚胎，一般建议对扩张期囊胚进行活检，主要对D5~D6的囊胚进行活检，如果D6观察为早期囊胚或者临界囊胚，也可以在D7早上对达到实验室活检标准的囊胚进行活检，尽量避免6期的活检。活检时机有时需要进行多次观察，对于非时差培养的胚胎，这增加了箱外观察次数，有时由于实验室工作负荷，不一定都能确保合适的活检和冷冻时机。配制显微操作皿时，需注意维持渗透压稳定，如果渗透压升高，囊胚放入活检液滴后出现皱缩(特别是5/6期囊胚)可能导致ICM不清晰，增加活检难度；活检过程中对部分细胞的牵拉和激光不当切割可能造成细胞核断裂，形成人为的染色体嵌合；且活检的细胞断裂处容易黏附贴壁，可能导致转管失败及样本丢失。在活检取材过程中，还要注意避免吸入胚胎碎片和胚胎自发排出的卵裂球，以免影响检测结果等诸多需要注意的操作细节。
3结语
PGT获取标本的可靠性是检测结果能准确代表胚胎信息的前提条件，获取标本的主要方式是通过活检。此外，无创/微创的SBM和BF的收集送检也是获取植入前胚胎检测标本的方式之一。样本收集的过程具有严格操作流程和风险管理细节。由于植入前胚胎的检测样本的特殊性，还需要充分认识误诊风险和检测局限性。
