多囊卵巢综合征（PCOS）患者行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗中，由于获卵多，雌二醇（estradiol，E2）水平高，常引起卵巢过度刺激综合(OHSS)[1]这种医源性疾病发生，为患者的健康和经济带来负担。为预防或降低中重度OHSS带来的危害，如今不少学者将全胚冷冻用于临床。我中心自2010年4月引进玻璃化冷冻技术，解冻胚胎移植妊娠率明显增加，故本研究回顾性分析PCOS患者中有明显OHSS发生者进行玻璃化全胚冷冻，并在2-3个月后行解冻移植后的应用效果，为临床处理提供依据。
1资料与方法
1.1研究对象选择本院2010年4月到2012年7 月间来院首次行IVF-ET或卵胞质内单精子注射术(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)的382例PCOS患者为研究对象，年龄为21-44岁，不孕年限为1-20年，其中原发不孕243例，继发不孕139 例，共促排382个周期，其中有2例卵子发育差，4 例未受精，7例胚胎发育差被取消。250例于取卵后第3d进行胚胎移植(A组)。119例因为预防OHSS发生，（117例向中度OHSS发展，2例向重度OHSS发展）行全胚冷冻，其中玻璃化冷冻胚胎115例（113例中度，2例重度）；2-3个月后，行首次解冻移植，共95个周期(B组)，所有患者均知情同意。
入组患者均符合2003年鹿特丹PCOS诊断标准，以下3项中至少有两项：⑴稀发排卵或无排卵；⑵有高雄激素血症或高雄激素的临床表现（如多毛、痤疮等）；⑶月经周期或黄体酮撤退后出血2-5d行超声检查，显示双侧卵巢均有≥12个且直径2-9mm的小卵泡，即卵巢多囊样改变，和（或）卵巢体积增大[每侧＞10ml，卵巢体积（V·m-3）=0.5× 长×宽×厚]；⑷并除外高雄激素血症的其它原因，如先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、雄激素分泌性肿瘤、21-羟化酶缺乏性非典型肾上腺皮质增生等；并排除子宫内膜异位症、子宫肌瘤和其他可能影响胚胎着床的因素。
本中心有OHSS高危因素者全胚胎冷冻的标准：获卵数≥20枚，胚胎移植(ET)日患者双侧卵巢平均直径≥70mm，且有腹胀、腹水等临床症状和体征。两组在年龄和不孕年限及基础性激素血值上比较均无差异。
OHSS分型标准：⑴轻度，血E2水平≥1500pg/ml；卵巢增大，但直径≤5cm；可伴有轻度腹胀不适，恶心、呕吐或腹泻等。⑵中度，在轻度的基础上，有腹水，卵巢直径＞5cm，＜12cm，可伴有腹胀、腹痛等。⑶重度，在中度的基础上，卵巢直径≥12cm，伴有胸水、腹水，血液浓缩，高凝状态，肾功能异常，少尿或无尿，低血容量性休克。
1.2研究方法
1.2.1促排卵方案患者接受常规超长方案或长方案促排卵。超长方案即月经第2-3d使用GnRH-a
（醋酸曲普瑞林，长效达菲林，3.75mg/支，法国博福-益福生制药公司）3.75mg肌注降调节，垂体完全降调节后（一般为注射后28-35d）来院使用促性腺激素（Gn）；长方案即妈富隆或达英-35自月经第3-5d开始口服，1片/d，月经第18-22d使用长效达菲林1.1mg-1.25mg肌注或达必佳0.1mg/d降调节，降调节12-16d开始使用Gn。Gn启动剂量为注射用重组人促卵泡素（r-FSH，Gonal-F，75IU/支，瑞士Serono公司）或尿促性腺激素(HMG，75IU/支，丽珠集团)，根据阴道B超监测到的卵泡发育情况以及检测到的生殖激素水平调整Gn用量。当B超监测下至少有1个优势卵泡平均直径达20mm以上或至少2个优势卵泡平均直径达18mm以上时，停用Gn，当晚肌注重组人绒促性素(r-hCG，艾泽，250μg/支，瑞士Serono公司)，34-36h后经阴道B超引导下行穿刺取卵术，生殖激素水平的测定均采用瑞士罗氏公司生产的化学发光免疫分析仪及配套试剂。
根据适应证采用常规IVF或ICSI进行授精，受精后第2d、第3d观察胚胎发育情况。胚胎评分采用WIH评分法，选择胚胎细胞数7-9个，细胞碎片≤25%，对称的胚胎进行冷冻。
1.2.2玻璃化法冷冻及复苏方法胚胎在基础液(含20%SSS的G-Mops)中2min然后转入预处理液V1（含7.5%EG和7.5%DMSO的基础液）4min再转入玻璃化冷冻液V2（含15%EG和15%DMSO的基础液)中平衡30-40s。用冷冻环装载胚胎后，迅速投入液氮中冷冻。复苏时迅速移至预热至37℃的1M 蔗糖的复苏液中1min，再移入0.5M蔗糖复苏液中3min，然后置于基础液中6min。最后将胚胎移入胚胎移植培养液。冷冻与复苏操作均在常温下操作，胚胎复苏存活的标准为：复苏后成活卵裂球数≥50%。
1.3冻融胚胎移植周期内膜准备方式及移植时机的选择
1.3.1人工周期月经周期第2-3d，口服戊酸雌二醇(补佳乐，德国先灵公司)6mg-8mg/d，7-8d后B 超监测内膜厚度，内膜增长不理想者可加量至8mg-10mg/d，当内膜厚度≥8mm，加用黄体酮(中国浙江仙琚制药公司)80mg/d，2-3d后移植。
1.3.2促排卵周期月经第3-5d，克罗米芬或者来曲唑加用HMG促排卵，当优势卵泡≥1.75cm，肌注HCG1万IU，不管卵泡是否排出，2d后加用黄
体酮40mg-60mg/d，肌内注射，2-3d后移植。
移植1-3枚可利用胚胎，移植后给予黄体酮进行黄体支持，移植后12-14d，抽取静脉血检测β-hCG水平，以判断是否妊娠，并于移植后30d行阴道B超检查，以观察到孕囊内有胚芽、原始心管搏动为临床妊娠。
1.4统计学方法采用SPSS17.0软件处理，计量资料数据以均数±标准差或百分率表示，符合正态分布，方差齐两两比较则采用t检验，方差不齐则采用用t检验；不符合正态分布，则采用秩合检
验。计数资料采用检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组患者行IVF-ET治疗情况比较根据入组情况，PCOS患者中因为OHSS发生行玻璃化全胚冷冻者即B组，在Gn过程中Gn天数、HCG日E2 水平、HCG日P水平、获卵数均明显高于新鲜周期移植组A组(P＜0.05)。两组间Gn总量、HCG日内膜厚度、受精率、优胚率、差异无统计学意义(P＞0.
05)，见表1。
2.2两组移植周期妊娠率、种植率、流产率及宫外孕率比较B组玻璃化全胚冷冻后的复苏率96.6%。与A组新鲜周期移植后相比，两组移植胚胎数、临床妊娠率、种植率、双胎率和流产率差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。
3讨论
3.1玻璃化全胚冷冻和OHSS的关系现在的IVF-ET治疗更倾向于安全、有效、经济的方式。最近，随着接受IVF-ET治疗的PCOS不孕患者越来越多，OHSS的发病率也有明显的增加，依据病情的严重程度可分为轻中重3级在本研究中，382例行IVF-ET治疗的PCOS患者取卵后，共有119 例全胚冷冻，其中115例向中度OHSS进展，2例向重度OHSS进展。OHSS主要的病理生理改变是血管通透性增加，引起血液浓缩、腹水、胸水，肝肾功能损害，血栓形成，严重者可危及生命。其发病机制不清楚，只能对症治疗，所以重在预防。在年轻的PCOS高反应患者中，全胚冷冻通过避免内源性HCG对卵巢的刺激作用，待2-3个月后患者OHSS症状消失，生理、心理都恢复后，再行玻璃化解冻移植，是预防OHSS进一步发展的重要手段。
在本研究中，根据是否玻璃化全胚冷冻，我们将PCOS患者分为两组新鲜胚胎移植组与玻璃化全胚冷冻后行FET组。两组患者基本情况如年龄、不孕年限和基础性激素血值上比较均无差异。与本中心全胚冷冻的标准相对应，玻璃化全胚冷冻组HCG日E2水平、HCG日P水平、获卵数均高于新鲜移植组(P＜0.05)。新鲜胚胎移植组在移植后有7例发生中度OHSS的患者，占促排卵后移植周期总数的2.8%；而玻璃化全胚冷冻组在取卵后未移植就已有113例患者向中度OHSS发展，2例向重度OHSS发展。玻璃化全胚冷冻组由于避免了内源性HCG的影响，使OHSS不能进一步发展，降低了这些年轻的PCOS患者的治疗风险。
3.2玻璃化冷冻技术对妊娠率的影响我们运用的玻璃化法技术最初是1998年Mukaida等采用，他们以EG为基本冷冻液对人类4-8个细胞的胚胎进行了玻璃化冷冻复苏移植，1例成功分娩双胞胎。此后，世界各地相继开展了人类胚胎玻璃化冷冻的临床研究。它的原理是高浓度的冷冻保护液在快速降温过程中由液态直接变为极其粘稠的、无结构的固化状态，从而避免冰晶的形成。玻璃化冷冻胚胎与程序化冻存相比具有更好的复苏和着床能力，是现阶段有效和相对安全的胚胎冷冻方式在我们统计结局中，玻璃化法技术解冻复苏率96.6%，移植后妊娠率为56.84%，和新鲜周期妊娠率60.00%相比没有统计学意义。
3.3全胚冷冻后移植对子宫内膜的影响胚胎移植后，胚胎与子宫内膜发育的同步化是着床的关键。有研究表明刺激周期大量促性腺激素的应用使子宫内膜发育提前。刺激周期非常高的雌激素水平使子宫内膜孕酮受体较早表达，血液中高雌激素和孕酮水平影响了子宫内膜表面的基因表达，从而改变了子宫内膜的正常容受性。本研究中，因全胚冷冻标准，玻璃化全胚冷冻组患者HCG 日血E2水平、P水平均高于A组。而在替代周期行冻融胚胎移植由于子宫内膜没有受到促排卵药物以及非生理性升高的影响，胚胎与子宫内膜同步性更好，胚胎更容易着床。但在本研究中两组受精率和优质胚胎率无差异，种植率和临床妊娠率也无差异，这可能需要进一步的更大样本的研究。
综上所述，对于易发生OHSS的PCOS患者进行玻璃化全胚胎冷冻，待2-3个月后行胚胎解冻移植，与高危患者行新鲜周期胚胎移植相比，即避免了严重的OHSS发生，又不影响着床率和妊娠率。
