体外受精－胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）是目前治疗不孕症最重要的方法之一。尽管在过去的几十年里，ＩＶＦ－ＥＴ技术取得了很大进展，但仍有部分患者无法成功妊娠。为了提高临床妊娠率，在临床上通常会移植多枚胚胎，这不仅造成胚胎的浪费，而且增加了多胎妊娠率和母婴并发症的发生率，包括早产、低出生体重儿、新生儿脑瘫、学习认知障碍及发育迟缓等。有研究显示，２０１１年美国出生的婴儿中，３６％的双胎及７７％的三胎及以上妊娠均来源于辅助生殖技术（ＡＲＴ）［２］。１次分娩诞生１个健康的婴儿应该是辅助生殖治疗的最优目标［３］。而选择最具有发育潜能的胚胎进行移植是ＡＲＴ中提高临床妊娠率、实现单胚胎移植的关键。
在目前的临床应用中，大部分中心会移植卵裂期胚胎或囊胚，与卵裂期胚胎移植比较，囊胚移植可以更好地进行胚胎选择、改善子宫内膜的同步性，能够显著提高种植率，降低流产率［４］。与受精后第３天（Ｄ３）卵裂期胚胎及Ｄ５囊胚移植相比，Ｄ４胚胎移植有一定的优势。众所周知，自然受孕过程中胚胎在受精后第４日时进入子宫腔，Ｄ４胚胎移植更符合生理过程。与Ｄ３胚胎比较，Ｄ４胚胎已经具有激活的胚胎基因组，且在体外受精后第４日，子宫收缩强度降低，子宫内膜的容受性提高［５］；有研究报道Ｄ４胚胎移植的成功率显著高于Ｄ３胚胎［６］。Ｄ４胚胎移植比Ｄ５胚胎移植缩短了培养时间，可以避免因胚胎体外培养时间的延长导致的基因后天修饰异常［７］。但Ｄ５胚胎移植仍然存在因胚胎发育阻滞或囊胚质量差而取消移植的潜在风险。Ｚｈａｎｇ等［８］研究表明Ｄ４胚胎移植组的年龄和胚胎情况均优于Ｄ５胚胎移植组，但两组的临床妊娠率和活产率均无显著性差异。另有研究报道Ｄ４胚胎移植和Ｄ５胚胎移植组的种植率、临床妊娠率、活产率、足月分娩率及异位妊娠率均无显著差异［９－１０］。Ｌｉ等［１１］的研究结果表明Ｄ４胚胎移植的足月出生率显著高于Ｄ５囊胚。有动物实验表明，长时间培养的胚胎中，与凋亡、氧化应激、缝隙连接形成相关的印记基因的表达存在差异［１２］。也有研究报道Ｄ５囊胚移植发生早产、先天性异常、单卵双胎、出生体重增加、胎龄较大的风险可能更高［７，１３－１４］，但其具体机制尚需要进一步研究。
２０１１年伊斯坦布尔共识［１５］提出了Ｄ４胚胎评价的标准，为Ｄ４胚胎评分提供了参考和依据，但目前尚缺乏选择Ｄ４胚胎统一的评价标准，这成为限制Ｄ４胚胎移植临床应用的主要因素。本研究比较了不同胚胎移植数目的３种不同发育速度（部分融合、完全融合和早期囊胚）的Ｄ４胚胎妊娠结局，以期为Ｄ４胚胎移植的选择提供依据和参考。
资料与方法
一研究对象及分组
回顾性分析２０１９年１月至２０２２年６月期间在邢台不孕不育专科医院生殖中心行ＩＶＦ－ＥＴ治疗的４７１个周期的临床资料。纳入标准：（１）年龄＜４０岁；（２）获卵数≥５枚；（３）促排卵方案为长效长方案；（４）行ＩＶＦ－ＥＴ治疗的患者；（５）在受精后第４日行融合期胚胎或早期囊胚移植；（６）移植胚胎均为正常受精，碎片率均≤２０％，无空泡、无多核证据。排除标准：（１）存在纵隔子宫、双子宫等子宫畸形者；（２）使用解冻精子进行受精的患者。本研究符合《赫尔辛基宣言》，且经邢台不孕不育专科医院伦理委员会审批通过［伦理号：（２０１８）伦审第（０９）号］
根据移植胚胎发育速度将Ｄ４胚胎移植周期分为３组：部分融合组（移植的胚胎为部分融合胚胎），完全融合组（移植的胚胎为完全融合胚胎）和早期囊胚组（移植的胚胎为早期囊胚）；又根据移植胚胎数量不同分为单胚胎移植组和双胚胎移植组。移植胚胎数量根据患者自身情况及胚胎质量决定，双胚胎移植组中移植的两枚胚胎均为部分融合、完全融合胚胎或早期囊胚，排除交叉移植（如１枚部分融合胚胎＋１枚完全融合胚胎）的周期。分别比较单胚胎移植和双胚胎移植患者不同Ｄ４胚胎发育速度亚组的妊娠结局。
二、诊疗回顾
１．卵母细胞获取及受精：应用长效长方案促排卵，双侧卵泡至少２枚直径达１８～２０ｍｍ以上时，于当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ，珠海丽珠制药）５０００～１００００Ｕ，注射后３６．５ｈ左右行阴道超声引导下取卵，获得卵丘卵母细胞后，洗涤两遍，立即置入三气培养箱中培养。取卵当日经手淫法获得精液，经过优化处理后于取卵后３～４ｈ进行ＩＶＦ受精，调整精子受精密度为２００００个／卵母细胞，受精后４～６ｈ拆除卵母细胞周围颗粒细胞，继续置于三气培养箱中培养。所有胚胎培养均使用瑞典ＶｉｔｒｏｌｉｆｅＧ５系列培养液。
２．胚胎培养及移植：受精后１６～１８ｈ观察受 精情况，记录原核（ＰＮ）数目，２ＰＮ为正常受精；受精后第２日和第３日评估卵裂期胚胎质量，记录胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀，第２日若发现有细胞多核、空泡等则进行记录。取卵当日即肌肉注射黄体酮注射液（浙江仙琚制药）进行黄体支持。根据ＨＣＧ注射日雌二醇（Ｅ2水平，移植日给予适量Ｅ补佳乐，拜耳医药，德国）补充，移植当日常规使用黄体酮（安琪坦，博赏医药，法国）８０ｍｇ口服或阴道给药进行黄体支持。
３．妊娠结局判断：移植后１４ｄ查血β－ＨＣＧ确定ＨＣＧ阳性（ＨＣＧ≥１０Ｕ／Ｌ），移植后２８ｄ阴道超声检查见孕囊者定义为临床妊娠；孕１２周内妊娠丢失定义为早期流产。
４．胚胎形态学评分：在受精后第３日，根据每个胚胎的卵裂球数目、大小和碎片等情况进行形态学评分。其中细胞数≥６，卵裂球大小均一或略微不均一，形态规则或欠规则，碎片率≤５０％的胚胎为可用胚胎。
在受精后第４日［受精后（９４±１）ｈ］，结合伊斯坦布尔共识［１５］对Ｄ４胚胎质量进行评估记录，标准如下：卵裂期胚胎（记录细胞数）：卵裂球之间没有融合迹象；部分融合胚胎（记录卵裂球融合比例）：卵裂球之间出现融合迹象，部分细胞之间的胞膜界限不清晰，细胞融合比例０％～９９％；完全融合胚：所有卵裂球均融合到一起，各细胞胞膜界限不清晰，胚胎形态像一个大细胞；早期囊胚：细胞数量明显增多，各细胞之间的界限再次显现，部分细胞呈月牙形、梭形，且细胞间出现腔隙，形成早期囊胚。均记录碎片比例及空泡。本中心根据获得的Ｄ４胚胎质量及患者身体状况选择１～２枚最优的胚胎移植，伊斯坦布尔共识［１５］中提出，发育到完全融合及以上胚胎为质量较好的胚胎，因此在有完全融合及早期囊胚的情况下，大部分患者会采用单胚胎移植。
５．观察指标：Ｄ３可用胚率＝Ｄ３可用胚数／卵裂数×１００％；
临床妊娠率＝临床妊娠周期数／移植。周期数×１００％；种植率＝种植胚胎数／移植胚胎数×１００％；
多胎率＝胎囊数≥２个的周期数／临床妊娠周期数×１００％；早期流产率＝早期流产周期数／临床妊娠周期数×１００％；
晚期流产率＝晚期流产周期数／临床妊娠周期数×１００％。
三、统计学分析
采用ＳＰＳＳ２２．０统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差，表示，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的数据用中位数（四分位间距）Ｐ若方差齐用Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ方法检验，若不齐则用Ｗｅｌｃｈ’ｓ 方法检验；计数资料用构成比或率（％）表示，组间比较采用χ检验；临床妊娠的影响因素分析采用二元Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析法。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
一患者基本资料比较
不同胚胎移植数目的不同发育速度亚组间患者年龄、不孕年限、不孕类型、基础性激素水平、ＨＣＧ
注射日激素水平及不孕因素占比等均无显著性差异（Ｐ＞０．０５），详见表１。
二、各组患者获卵数、胚胎发育情况及移植日子宫内膜厚度比较
不同胚胎移植数目的不同发育速度亚组间比较结果显示，单胚胎移植组中，早期囊胚组的获卵数显
著高于部分融合组（Ｐ＜０．０５），Ｄ３可用胚胎率显著高于完全融合组（Ｐ＜０．０５）；双胚胎移植组中，早期囊胚组的Ｄ３可用胚胎率显著高于部分融合组和完全融合组（Ｐ＜０．０５）。单胚胎移植或双胚胎移植组中，２ＰＮ受精率、２ＰＮ卵裂率和移植日内膜厚度在不同亚组间均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）（表２）。
三、各组患者妊娠结局比较
单胚胎移植或双胚胎移植组中，随着移植胚胎级别逐渐成熟（从部分融合到早期囊胚），不同亚组
间临床妊娠率和种植率逐渐增高。双胚胎移植组中，早期囊胚组的临床妊娠率显著高于部分融合组
和完全融合组（Ｐ＜０．０５），种植率显著高于部分融合组（Ｐ＜０．０５）；完全融合组及早期囊胚组的多胎率有高于部分融合组的趋势，但尚无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；３亚组间的早期流产率和晚期流产率均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。单胚胎移植组中，部分融合组临床妊娠率较低，仅为４５．４５％；双胚胎移植组中，部分融合组和完全融合组的临床妊娠率无显著性差异（Ｐ＞０．０５），但均显著高于单胚胎
