不明原因不孕症(Unexplained infertility,UI)是指有规律、未避孕性生活1年以上未孕,且经过不孕症相关的常规检查评估后仍然未能确定具体不孕病因的状态。UI是一种排除性诊断,约占不孕症的10%~30%。美国生殖医学协会(ASRM)UI治疗指南(2020版)中明确推荐诱导排卵(OI、卵巢刺激(OS)联合宫腔内人工授精(IUI)、体外受精-胚胎移植(IVF-ET)为UI阶梯式的积极治疗。IVF与期待治疗、OI和IUI相比是最有效的治疗措施，特别是对于年纪大(≥35岁)且不孕年限较长(大于3年)的患者,已被证实具有更高的妊娠率及活产率,同时缩短了治疗时间、减轻了患者心理负担。然而与其他原因不孕人群相比,切患者行常规IVF助孕成功率仍较低。控制性卵巢刺激(COS)方案作为IVF-ET成功的重要环节,目前大多采用两种:激动剂长方案与拮抗剂方案。不同的方案各有利弊,适用于不同的不孕患者。关于UI患者COS方案的研究较少,哪种方案更适合UI忠者尚未明确,如何根据UI患者自身特点选择合适的COS方案从而改善临床妊娠结局，减少并发症及费用等,是目前临床上亟待解决的问题。本研究回顾性分析黄体期长方案与拮抗剂方案应用于UI人群IVF/ICSIET的促排卵结果及妊娠结局,以期为UI患者助孕治疗中促排卵方案的选择提供更多参考。
资料与方法
一、研究对象
回顾性分析2016年1月至2022年7月于广西医科大学第一附属医院广西生殖医学研究中心首次行IVF/ICSI-ET助孕的UI患者的临床资料。纳入标准:(1)首次实施IVF/ICSI-ET助孕,采用黄体期长方案或拮抗剂方案促排卵:(2)月经周期规律，超声检查明确有正常排卵:(3)输卵管造影(包括碘油:超声造影)或经腹腔镜检查证实至少一侧输卵管通畅,并至少行2次以上IUI未孕;(4)年龄<40岁符合不孕症诊断;(5)基础卵泡刺激素(bFSH)10U/L,基础窦卵泡计数(AFC)>7个;(6)男方精液未见明显异常。排除标准:(1)经腹腔镜或者输卵管造影提示存在盆腔因素不孕,如盆腔子宫内膜异位症、输卵管积液、盆腔结核、生殖道畸形等;(2)合并子宫腺肌症、直径大于4cm的子宫肌瘤、宫腔粘连或影响IVF助孕结局的疾病等:(3)既往有自身免疫性疾病和遗传病史:(4)排卵障碍患者。本研究通过广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批号2023-E073-01)。所有入组患者进入治疗前均签署书面知情同意书。
依据标准共纳入患者278例(共278个[VF/ICSI-ET周期),根据促排卵方案不同,分为拮抗剂方案组(拮抗剂组)80个周期和黄体期长方案组(简称长方案组)198个周期;又按照年龄不同分为≤35岁组(220个周期)和>35组(58个周期)。
二、研究方法
1.COS方案:拮抗剂方案:于月经周期第2~3天根据AFC、bFSH水平及体质量指数(BMD,开始予以促性腺激素(Gn)75~300U/d启动促排卵,固定方案,期间根据卵泡发育情况及E2水平适当调整Gn用量,Gn用药第5~6天加用醋酸西曲瑞克(思则凯,默克雪兰诺,瑞士)0.25mg/d至HCG注射日。当1~2个主导卵泡直径≥18mm,或3个主导卵泡直径≥17mm时扳机,给予人绒毛膜促性腺激素(HCG)6000~10000U肌肉注射或者重组HCG 250μg皮下注射,有中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)倾向的患者给予促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a,达必佳,辉凌,德国)0.2mg皮下注射,同时取消鲜胚移植。扳机后34~36h经阴道超声引导下行取卵术。
黄体期长方案:月经周期第20天或排卵后3-5d抽血检测孕酮(P)水平明确排卵后,肌肉注射长效GnRH-a(达菲林,益普生,法围,3.75mg/支),个体化用量1.0~1.5mg降调节;在用药第14天左右达降调节标准(E<1835pmol/L,LH<5U/L,FSH<5U/L,子宫内膜厚度<5mm,双侧卵巢AFC直径<5~10mm,且无功能性囊肿)后,根据年龄、基础AFC、bFSH水平及BMI等给予Gn75~300U启动促排卵,Gn用量调整标准同拮抗剂方案,当2~3个主导卵泡直径≥18mm时扳机,给子HCG6000~10000U肌肉注射或者重组HCG250"g皮下注射,有中重度OHSS倾向的患者HCG适当减量,扳机后36h经阴道超声引导下行取卵术。
2.胚胎培养及评分:取卵当日结合男方精液质量及获卵情况,进行IVF/ICSI授精,之后根据本中心的实验室常规操作行胚胎培养。根据卵裂球大小均匀与否及碎片率,参照《人类卵裂期胚胎及囊胚形态学评价中国专家共识》对胚胎进行评级,受精后16~20h查看受精结果,观察到2个卵原核(2PN)为正常受精:受精72h后观察胚胎评分达到工、I级,且卵裂球细胞数目≥4个,为可移植胚胎:评分达工、Ⅱ级且卵裂球细胞数目7~9个,为优质卵裂期胚胎:培养至第5~6天,囊胚评分≥3BB为优质囊胚。
3.胚胎移植及黄体支持:取卵后根据胚胎情况培养至第3~5天进行卵裂胚或囊胚移植,本中心以移植第3天卵裂胚为主,根据患者情况移植1~2枚胚胎。若存在中重度OHSS高风险、内膜因素、扳机日P过高及个人原因等予全胚冷冻。鲜胚移植的患者从取卵日开始行黄体支持,每日予地屈孕酮(达芙通,苏威,荷兰)10mg,bid,或黄体酮胶囊(益玛欣,浙江仙琚)100mg,bid,以及黄体酮注射液(浙江仙琚)40~60mg肌肉注射,qd,或黄体酮凝胶(雪诺同,默克雪兰诺,德国)90mg阴道用药,qd,常规黄体支持治疗直至验孕日。如确定宫内妊娠,继续黄体支持并逐步减量，至妊娠10~12周停止黄体支持。
4.妊娠结局评估:鲜胚移植后2周测定血清β-HCG水平,β-HCG阳性后的妊娠丢失为生化妊娠;移植后4~5周行阴道B超检查,见孕囊者为临床妊娠,包括宫内妊娠和宫外妊娠;孕12周以前的流产为早期流产。中重度OHSS的诊断依据2016年ASRM发布的《中度和重度卵巢过度刺激综合征的预防和治疗指南》。
5.观察指标:(1)促排卵情况:Gn启动剂量Gn使用天数、Gn总量、HCG扳机日子宫内膜厚度及E2水平、获卵数:(2)受精及胚胎发育情况(参照2018年《胚胎实验室关键指标质控专家共识》]进行评估):正常受精率(2PN数/总卵母细胞数x100%)可移植胚胎率(可移植胚胎数/卵裂胚胎数x100%)、优质卵裂胚率(优质卵裂胚数/正常受精卵裂胚数X100%)、囊胚形成率(囊胚形成数/行囊胚培养的卵裂胚数x100%)优质囊胚率(优质囊胚数/囊胚形成数x100%);(3)妊娠结局指标:胚胎种植率(着床胚胎数/移植胚胎数x100%)、临床妊娠率(临床妊娠周期数/鲜胚移植周期数X100%)生化妊娠率(生化妊娠周期数/鲜胚移植周期数X100%)早期流产率(早期流产周期数/临床妊娠周期数X100%);(4)安全性指标:中重度OHSS发生率(中重度OHSS发生人数/进入促排卵周期人数x100%)。
三、统计学方法
采用SPSS250软件进行统计学分析。连续性变量符合正态分布的采用均数士标准差(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验。分类变量以率(%)表示,组间比较采用卡方检验,当n<40或T<1时采用确切概率法。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
一、拮抗剂组和长方案组忠者基本资料比较
本研究共纳入278例忠者(278个周期),年龄范围22~39岁,拮抗剂组80个周期,长方案组198个周期。两组的平均年龄、BMI、不孕年限、bFSH及AFC之间比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。
二、拮抗剂组和长方案组促排卵及受精、胚胎发育情况比较
1.COS情况:在两组G启动剂量相似的情况下,拮抗剂组的Gn使用天数、Gn总量、HCG扳机日子宫内膜厚度、获卵数显著低于长方案组(P均<005),HCG扳机日血清E2水平及预防OHSS周期取消率亦显著低于长方案组(P均<0.05);但两组中重度OHSS发生率无显著性差异(P>0.05)(表2)。
2.受精及胚胎发育情况:长方案组的受精率:正常受精率、可移植胚胎率、优质卵裂胚率、囊胚形成率稍高于拮抗剂组，优质囊胚率稍低于拮抗剂组但两组间尚无显著性差异(P>0.05)(表3)。 
3.鲜胚移植的妊娠结局:拮抗剂组80个周期中全胚冷冻16个周期(包括OHSS高风险9个周期,宫腔因素取消移植6个周期,扳机日P水平高1个周期)异常受精1个周期,共进行鲜胚移植63个周期。长方案组198个周期中全胚冷冻54个周期[包括OHSS高风险46个周期,宫腔因素取消移植4个周期,扳机日P水平高2个周期、患者因素(腹痛/发热)2个周期、异常受精1个周期、未受精3个周期,共进行鲜胚移植140个周期。两组鲜胚移植周期的胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率和早期流产率均无显著性差异(P>0.05),但长方案组的胚胎种植率和临床妊娠率稍高于拮抗剂组，生化妊娠率和早期流产率稍低于拮抗剂组(表4)。
三、不同年龄组中不同促排卵方案亚组的各项指标比较
年龄≤35岁的患者中,拮抗剂组的AFC显著高于长方案组,Gn使用天数、Gn总量及HCG注射日内膜厚度均显著低于长方案组(P<005);拮抗剂组的可移植胚胎率、囊胚形成率显著低于长方案组(P<0.05);两组的胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、早期流产率均无显著性差异(P>0.05)(表5~7)。
年龄>35岁的患者中,拮抗剂组的bFSH、Gn使用天数及Gn总量均显著低于长方案组(P均<0.05);拮抗剂组的受精率显著低于长方案组，可移植胚胎率、囊胚形成率及优质囊胚率则显著高于长方案组(P均<0.05),这可能与该年龄亚组的周期数较少有关;长方案组的胚胎种植率、临床妊娠率稍高于拮抗剂组，生化妊娠率及早期流产率稍低于拮抗剂组，但尚无显著性差异(P均>005)(表5~7)。
讨论
UI往往并非没有原因,只是常规检测手段未能查出,其可能的病因包括隐匿性输卵管因素、子宫内膜异位症、免疫因素、潜在的精子/卵母细胞质量异常、受精障碍、胚胎植入失败、遗传缺陷等。
IVF助孕作为UI患者治疗的有效手段,如何选择合适的促排卵方案进行个体化精准治疗是提高IVF助孕成功率及安全性的关键步骤。目前关于UI患者促排卵方案比较的研究较少，本研究旨在通过比较黄体期长方案与拮抗剂方案应用于U患者促排卵的助孕结局,探讨两种方案在UI患者应用中的有效性与安全性，以期为临床决策提供更多参考。
有研究表明,与激动剂方案(包括黄体期长方案、早卵泡期长方案、超长方案)相比,在不同卵巢反应人群中使用拮抗剂方案可以减少Gn使用天数和用量以及OHSS发生率。还有研究提示拮抗剂方案所获胚胎质量与激动剂方案相似。本研究中,拮抗剂组Gn启动剂量与长方案组相比无统计学差异,但Gn使用天数及Gn总量显著低于长方案组(P<0.05),与上述研究结论一致。提示拮抗剂方案与黄体期长方案相比,不需要降调节,缩短了治疗时间,减少了患者返院次数,对患者更方便和经济,同时减少了促排卵时间及促排卵用药,具有较好的临床应用价值。此外，本研究结果提示拮抗剂组UI患者的可移植胚胎率、优质卵裂胚率、囊胚形成率、优质囊胚率与长方案组相似,这也与前述研究结论一致。但是对年龄进行分层后，≤35岁患者中拮抗剂组的可移植胚胎率及囊胚形成率显著低于长方案组(P<0.05),而>35岁患者中拮抗剂组的可移植胚胎率、囊胚形成率及优质囊胚形成率均显著高于长方案组(P<0.05),与前述研究结论不一致,考虑可能与年龄分层后样本量减少导致研究结果存在偏倚有关。
目前关于拮抗剂方案与激动剂长方案促排卵的临床结局仍存在争议。Yang等的一项纳入3672例卵巢储备功能正常患者的Meta分析提示,激动剂长方案与拮抗剂方案促排卵的临床妊娠率相似。在多囊卵巢综合征(PCOS)患者中也发现拮抗剂方案与激动剂长方案促排卵首次移植妊娠结局相似。但也有研究发现在卵巢正常反应人群中,新鲜周期的拮抗剂方案与激动剂长方案相比，胚胎着床率及临床妊娠率均降低，分析其可能原因与拮抗剂对子宫内膜容受性的负面影响有关;且上述研究的不同结论可能与样本人群不同有关。对于U患者,近年来有研究报道与拮抗剂方案相比，卵泡期长方案可提高UI患者的胚胎种植率、临床妊娠率及活产率,这可能与长方案通过充分降调节,改善了子宫内膜容受性继而提高种植率有关。约40%的UI患者存在隐匿型子宫内膜异位症!。激动剂超长方案及长方案常被认为是子宫内膜异位症患者经典的COS方案。有研究显示GnRHa可抑制子宫内膜异位症病灶，减少子宫内膜异位症炎性因子反应,改善盆腔微环境及免疫状态，提高内膜容受性,有利于胚胎着床,从而提高子宫内膜异位症患者行IVF助孕的成功率。此外,有实验通过蛋白质组学分析发现，应用拮抗剂方案比激动剂方案明显降低了子宫内膜的容受性。本研究结果显示长方案组的HCG扳机日内膜厚度显著高于拮抗剂组,这可能与黄体期长方案降调后改善了子宫内膜容受性有关,但长方案组的临床妊娠率仅稍高于拮抗剂组(436%vs.41.3%),尚未表现出显著性差异,考虑与长方案组HCG扳机日血清E2，水平较高影响胚胎着床有关,同时拮抗剂组HCG日E，水平的降低也更有利于胚胎种植。吴春香等对不同分期子宫内膜异位症患者行IVF/ICSI-ET治疗，共纳入583个周期,研究结果亦发现拮抗剂方案的着床率、临床妊娠率、活产率与长方案无显著差异，二者可获得相似的临床结局。
在安全性方面，虽然拮抗剂组和长方案组的中重度OHSS发生率没有显著性差异，但拮抗剂组HCG日因预防OHSS发生的周期取消率显著降低,与之前的研究结论一致,提示雌激素峰值水平与OHSS发生有关,雌激素越高,发生OHSS风险越大;而本研究中拮抗剂组HCG日E水平显著低于长方案组,提示拮抗剂方案发生OHSS风险更低，安全性更高。
综上所述,拮抗剂方案应用于UI患者并进行鲜胚移植可以获得与黄体期长方案相似的胚胎质量及妊娠结局，同时可以减少促排卵用药剂量及促排卵时间，且安全性更好。但本研究为单中心回顾性队列研究,样本量较小,后续还需要更大样本的前瞻性研究加以探讨验证。
