卵巢储备功能下降(DOR)是指卵巢功能不足由于卵巢内存留的卵母细胞数量减少或(和)质量下降,造成女性生育能力下降,同时伴有基础卵泡刺激素(FSH)水平升高、窦卵泡数(AFC)减少、抗苗勒管激素(AMH)水平降低。DOR在人群中的发病率约为10%~35%。
在生理状况下卵母细胞有一系列的保护措施来保障有且仅有一条精子穿过卵细胞膜,从而形成精原核并与卵原核融合成二倍体受精卵 。但在辅助生殖技术(ART)中,由于各种因素的影响譬如精液浓度、卵母细胞质量以及受精环境等,使得多精受精的发生率远远高于自然状态。这种多精受精卵发育成胚胎后移植回母体后可导致流产、多倍体畸形儿及葡萄胎的发生,因此在实验室中往往选择废弃。而DOR患者本身可获得的卵母细胞数量较少，旦出现多精受精会导致可移植的胚胎数降低甚至无胚胎可移植。降低DOR患者常规体外受精(IVF)过程中多精受精的发生率至关重要。因此,本研究选择DOR患者作为研究对象,探讨其常规IVF多精受精发生的影响因素,以期更好地指导临床医生开展个体化促排卵治疗,降低多精受精的发生,提高卵子的利用率,继而增加可移植胚胎数目,增加患者受孕机会。
资料与方法
一、研究对象
本研究为回顾性病例对照分析。选择2020年9月至2023年5月在山西省运城市中心医院生殖医学科接受常规IVF助孕治疗的399例DOR患者(共399个周期)为研究对象。
纳人标准:(1)临床诊断为不孕症;(2)采用高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案IVF助孕治疗;(3)符合临床DOR诊断标准:双侧卵巢基础AFC<5~7个,或AMH<1.1ng/ml,或连续两个月经周期的基础FSH≥10U/L。
排除标准:(1)行补救ICSI者;(2)不孕因素为男方因素;(3)夫妻双方任意一方染色体核型异常:(4)复发性流产患者等。
分组情况:按照本周期是否发生多精受精,将399个周期分为两组,分别是正常受精组(272个周期)和多精受精组(127个周期)。
二、研究方法
1.控制性促排卵(COS)及取卵:采用PPOS方案促排卵，于月经周期第2~3日起口服地屈孕酮(达芙通,雅培,荷兰)20mg/d,同时使用尿促性素(HMG;珠海丽珠制药)150~225U/d并联合肌肉注射FSH(丽申宝,珠海丽珠制药)75U/d,根据卵泡发育情况调整促性腺激素(Gn)用量,必要时添加促性腺激素释放激素拮抗剂[GnRH-ant;醋酸西曲瑞克(思则凯),默克雪兰诺,德国]直到HCG注射日。当1个主导卵泡直径≥18mm,或有2~3个卵泡直径≥16mm,或直径>14mm的卵泡数超过2/3,且血雌二醇(E2)水平与成熟卵泡数符合(每成熟卵泡E2水平915~1098pmol/L)时肌肉注射10000U尿源HCG(珠海丽珠制药)或重组人绒促性素(rHCG;艾泽,默克,意大利)250μg+HCG 2000U,进行扳机。HCG注射后36h经阴道超声引导穿刺取卵,抽吸直径14mm以上卵泡,将获取的卵-冠-丘复合物放入培养箱中培养2~4h。
2.精液处理及短时授精:取卵手术之前要求患者配偶禁欲2~7d。取卵当日告知患者配偶以手淫法将全部精液留置在取精杯中。待精液液化后,采用密度梯度离心和上游法相结合的方法来处理精液。密度梯度离心分离液使用Spermient(Cook,澳大利亚),洗涤液和上游液分别为配子缓冲液(Gamete buffer;Cook,澳大利亚)和受精培养液(Fertilization medium;Cook,澳大利亚)。采用四孔板授精,取卵前每孔加人0.6ml受精培养液,盖油放置于37℃、6%CO2:培养箱中过夜平衡。授精时取上游的最上层精子,通过精子计数每孔加人1.0x105条精子并在每孔放置2~3枚卵-冠-丘复合物,将四孔板放置在培养箱(37℃、6%CO2、5%O2饱和湿度)中孵育4~5h。
3.脱颗粒及受精观察:常规IVF授精4~5h后使用140μm的剥卵针(Cook,澳大利亚)剥除卵子周围的卵丘颗粒细胞,然后将卵母细胞转移至过夜平衡好的卵裂培养液(Cleavage medium;Cook澳大利亚)中观察第二极体是否排出。若有1/2的成熟卵子均可见明显的2个极体，则将卵母细胞放回培养箱继续培养,18h后再次观察受精情况,观察到2个原核(2PN)的受精卵判定为正常受精,3个及以上原核≥3PN)的受精卵判定为多精受精。
三、观察指标
本研究的主要观察指标有:(1)基础资料,包括女方年龄、不孕年限、不孕类型、不孕因素、体质量指数(BMI)、AFC、基础FSH和基础AMH水平;其中BMI的评价参考世界卫生组织(WHO)及之前文献的相关标准，分为正常体重(18.5kg/m2 ≤BMI≤24.9kg/m2)、超重(25.0kg/m≤BMI≤29.9kg/m2)和肥胖(BMI≥30.0kg/m2);(2)COS相关指标,包括Gn启动剂量、Gn总量、Gn天数、直径≥14mm卵泡数,以及扳机日E2、LH、孕酮水平及获卵数。
四、统计学分析
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料用均数士标准差(x±s)表示,组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的计量资料以中位数(四分位间距)[M(P25,P75;)]表示:组间比较使用非参数检验;计数资料用构成比或率(%)表示,组间比较采用c2检验。以是否发生多精受精为因变量,将单因素分析中P<0.05的相关指标为协变量进行Logistic回归分析,计算OR值及95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、纳入患者的整体情况及基本资料比较
本研究共纳人399个周期,其中272个周期无多精受精情况的发生,127个周期出现多精受精，多精受精在DOR患者的周期发生率为31.83%(127/399)。正常受精组和多精受精组患者间女方年龄、不孕年限、不孕类型和基础AFC比较均无显著性差异比较(P>0.05);两组间女方BMI正常和超重的比例亦无显著性差异(P>0.05),而多精受精组中女方BMI为肥胖的比例显著高于正常受精组(P<0.05)(表1)。
二、两组患者COS相关指标比较
两组患者的Gn启动剂量比较无显著性差异(P>0.05);多精受精组的Gn天数、Gn总量、扳机日E和孕酮水平、获卵数均显著高于正常受精组(P<0.05),扳机日LH水平则显著低于正常受精组(P<0.05)(表2)。
三、Logistic回归分析多精受精发生的影响因素
以是否发生多精受精为因变量(赋值1三是，0=否),以单因素分析中P<0.05的相关因素(包括BMI、Gn天数、Gn总量、扳机日E2和孕酮水平、扳机日LH水平及获卵数)为自变量,建立Logistic回归模型。多精受精和BMI相关赋值情况详见表3。
回归分析结果显示:Gn天数、Gn总量、扳机日E2、LH和孕酮水平未能进入回归方程(OR值分别为1.059、1.000、1.000、0.958和0.780,P>0.05),提示这些因素对多精受精的发生无显著影响;而女性BMI和获卵数进入回归方程(OR值分别为2.858、1.634,P值分别为0.020、0.000),提示这两个因素显著影响到多精受精的发生(P<0.05)(表4)。
讨论
在IVF的实验室操作中,多精受精的发生率在1%~10%。目前的研究表明卵子的成熟度、加精时高精子浓度、卵子透明带异常、卵泡液中高孕酮和高雄激素水平、体外操作过程中的环境因素等都可能导致多条精子进人卵母细胞。本中心患者一律严格按照实验室标准化操作流程进行操作，以尽量减弱体外环境和实验室人员操作对其多精受精的影响。为了避免精子情况对于多精受精的影响，本中心对加精浓度和授精时间都有严格把控。在本研究回顾性分析的399个DOR患者的常规IVF周期中，127个周期出现了多精受精,发生率为31.83%。
本研究结果表明在DOR人群中,多精受精组的肥胖人群比例显著高于正常受精组(P<0.05)提示DOR患者中肥胖可能与多精受精有关。多精受精组的Gn天数、Gn总量、扳机日E2和孕酮水平、获卵数均显著高于正常受精组(P<0.05),扳机日LH水平则显著低于正常受精组(P<0.05),同样提示这些因素可能会导致DOR患者多精受精的出现。在随后的多因素分析中,Logistic回归结果表明Gn的使用情况、扳机日E2、孕酮和LH水平对DOR人群多精受精的发生无显著影响(P>0.05)而获卵数和肥胖则与多精受精的发生有关,获卵数越多则多精受精发生的可能性越大(OR=1.634,P=0.000)。DOR合并肥胖的患者发生多精受精的概率是BMI正常DOR患者的2.858倍(OR2.858,P=0.020),提示肥胖和获卵数是DOR患者发生多精受精的独立危险因素。
在不孕不育症的相关研究中，肥胖与不孕一直是热点话题。有研究发现在肥胖小鼠的模型中，小鼠卵巢存在大量凋亡卵泡,卵母细胞体积变小,卵子成熟率降低。李沛等的报道中亦指出高BMI对卵子质量和授精结果有负面影响。肥胖从多个方面影响卵母细胞,包括减数分裂时染色质装配异常线粒体在结构、空间、代谢方面的异常,内质网功能异常等,进而影响卵母细胞的质量,导致多精受精的发生。最近有研究显示在短时间(3个月)内尽快减重对助孕结局有益。
获卵数也是IVF多精受精的危险因素之一,这与我中心之前的报道以及其他相关报道一致。有研究表明,过低或过高的获卵数均会使卵母细胞的正常受精率降低,异常受精率增高。但也有学者指出,卵母细胞质量和受精率与获卵数呈负相关,获卵数越少卵母细胞质量越高,但这些研究并不是针对DOR患者。对于DOR患者,她们本身的卵子数量较少,当获卵数相对较多时,本周期出现多精受精的概率也会随之增加。当然我们也不能排除由于获卵数增加导致的多精受精概率升高的现象是单纯的数学概率问题,其具体的机制仍需要后续进一步研究。
综上所述,DOR合并肥胖显著增加了常规IVF多精受精发生的概率。提示对此类患者行IVF助孕时应及时进行预处理,包括改善生活方式、增加运动、降低BMI等,若减重困难,则可以考虑改变受精方式来减少多精受精的发生。但因本研究统计资料有限,仅针对DOR患者的基本情况以及促排卵情况进行了多因素分析;且由于BMI低于正常范围人群的样本量过少,相关数据未纳人统计分析,故无法统计DOR合并低体重人群行常规IVF时多精受精的发生情况。
