TEAD4在人类着床前胚胎中调节CDX2上游的滋养层分化（⬅点击左侧文字观看视频）
研究问题：在小鼠和人类胚胎的着床前发育过程中，调节滋养层分化的主要途径是什么？
摘要答案：TEAD4在CDX2上游起作用，参与TE分化，因为TEAD4缺失的人类胚胎表现出受损的TE谱系分化。
众所周知：TEAD4是早期胚胎发育过程中最早的转录因子，在小鼠胚胎发育过程中，表达TE相关基因导致成功的TE分化和随后的囊胚腔形成。小鼠功能敲除研究表明，通过位点特异性重组使Tead4失活的Tead4缺失胚胎不表达TE特异性基因，包括尾型同源框蛋白2（Cdx2）和GATA结合蛋白3（Gata3），但内细胞团（ICM）特异性基因的表达不受影响。此外，切除Tead4会影响小鼠的胚胎发育和随后的囊胚腔形成。TEAD4在人类植入前发育过程中的作用还没有被明确的功能描述。
研究设计、大小、持续时间：将CRISPR-Cas9导入小鼠合子中，通过对4.5dpc胚胎（n=55）的下一代测序（NGS）评估编辑效率。观察Criscras9靶向（n=83）、假注射（n=26）和非注射培养基对照（n=51）小鼠胚胎的发育动力学。对Tead4靶向（n=57）和非注射培养基对照胚胎（n=94）进行免疫荧光分析。同样的方法也应用于体外成熟（IVM）中期II（MII）卵母细胞，在ICSI期间，CRISPR-Cas9靶向（n=74），或用作培养基对照（n=33）。
对象/材料、环境、方法：将靶向Tead4/Tead4外显子2的gRNA-Cas9混合物分别显微注射于小鼠2PN期合子或人IVM-MII卵母细胞及精子中。小鼠胚胎体外培养4d，人胚胎体外培养6d。每天评估胚胎发育和形态，然后在囊胚晚期进行详细评分。通过免疫染色和靶位点的NGS分析，评估CRISPR-Cas9导入后的成功靶向性。
主要结果和机会的作用：在小鼠中，我们证实了先前的发现，Tead4靶向胚胎的发育能力从桑椹胚期开始显著降低，靶向组的囊胚形成率为8.97%，而对照组和假手术组分别为87.23%和87.50%。晚期桑椹胚和囊胚期胚胎的免疫荧光分析证实Tead4、Cdx2和Gata3缺失，这是由于Tead4基因座的成功中断所致（n=57）。TEAD4的外显子2已成功靶向人类。共成功分析了21个不同发育阶段的胚胎，其中90,48%（19/21）的胚胎进行了CRISPR-Cas9基因组编辑的遗传修饰，7个囊胚被鉴定出只携带移码突变。与小鼠相比，人类靶向胚胎的发育能力（25%）与对照组（23%）没有显著差异。然而，目标组的囊胚形态和质量受到影响，主要表现为C级TE评分，包含的细胞很少。靶向囊胚（n=6）的免疫荧光分析证实，完全没有TEAD4及其下游TE标记物CDX2，编辑成功。
限制，谨慎的理由：CRISPR-Cas9种系基因组编辑导致具有可变表型外显率的多种编辑结果，其镶嵌性质使注射胚胎的表型分析和发育行为复杂化。
研究结果的更广泛意义：阐明调节滋养细胞谱系自我更新的进化保守分子机制可以为我们提供早期植入失败的基本见解。
试验注册号：不适用
