Oleg Sergeyev：
博士，罗蒙诺索夫莫斯科国立大学，俄罗斯。
瓦维洛夫遗传学研究所基因组与人类遗传学系，高级研究员。
孕妇叶酸不足与自然流产、低出生体重 (Molloy 等，2008) 和神经管缺陷 (Hibbard 等，1965) 有关。
2012 年世卫组织的推荐剂量为 400mkg / 天，包括食物叶酸(Nohr, Olsen et al. 2014)，2014 年丹麦 Nohr 等的研究，纳入调查 35914 人次
● 电话随访（是否使用补充剂）并登记胎儿死亡
● 服用多种维生素会增加胎儿死亡的风险 [HR 1.23 (1.06-1.42)]
● 然而，然而单独使用叶酸不增加胎儿死亡
2015 年 Gaskens 等用 EARTH 数据研究发现，ART 治疗中使用叶酸强化治疗的，患者人群中血清高叶酸和 Vit B12 和高活产率相关。
众所周知，叶酸及必需微量营养元素与神经管发育缺陷相关，WHO 推荐每天摄入 400mg 叶酸，包括食物来源叶酸和外源性补充叶酸。然而，数年前丹麦研究者进行了一项有关复合维生素和叶酸的队列研究，发现任何一种复合维生素使用可能会增加胎儿死亡风险；然而单独使用叶酸和胎儿死亡之间没有相关性；2015 年 Gaskins 等用 EARTH 数据研究发现，ART 治疗前使用叶酸强化治疗的患者人群中，血清高叶酸和 Vit B12 和高活产率相关。
研究 IVF 干预之前基础血清微量元素水平和单次拮抗剂方案鲜胚移植 ART 结局之间的关系。
研究数据符合多中心、随机的、盲蔽胚胎学家和 α- 促卵泡素等效性研究。
基础血清微量营元素指标有：叶酸、镁、VitB12、钙以及钙镁比值；观察的结局指标有：获卵总数、成熟卵子数、受精卵数、生化妊娠、临床妊娠、活产率。
监测指标（营养元素基础血清水平）：叶酸、镁、VitB12、钙以及钙镁比值；
观察的结局指标：获卵总数、成熟卵子数、受精卵数、生化妊娠、临床妊娠、活产率。
材料和方法研究课题介绍
● 在莫斯科 3 家大型辅助生殖诊所招募生育治疗的妇女
114 例 (2017-2018 年 ) 符合纳入标准 :
年龄 20-35 岁
月经周期 : 规律：21 -35 天
确定不孕原因 ( 输卵管和 / 或男性因素 )
首次或第二次 IVF/ICSI
18s ≤ BMI ≤ 30 kg/m2
卵泡刺激素 FSH 10 ＜ IU/I 和雌二醇水平＜ 50pg/ml( 月经周期 2-5 天 )；
AMH ≥ 1.0 ng/ml
4 ≤ AFC ≤ 15
最终纳入 108 名患者随访直到生产（2017-2019）
其中 98 名女性鲜胚移植
这个是我们研究招募和随访女性的流程图。在父母的研究中，有 100 多名女性最初严格按照所列的纳入标准入选年龄小于 35 岁虔诚和有某种政治倾向的妇女。其中一例拒绝参加。最终，我们排除了家庭以及其他可能影响临床结局的侧面影响。由于患者自身因素或者拒绝参与，该项研究最终纳入 108 例，其中 98 例患者进行新鲜胚胎移植。
研究设计流程图如下：
1、单次拮抗剂促排卵方案
2、固定每天注射rFSH剂量，注射5天
3、胚胎移植术后12-17天监测生化妊娠结局
4、移植后10周监测临床妊娠结局
这里是体外受精和研究方案的详细流程图。但是一种方案只使用于鲜胚移植，对一名女性的一个周期，并在前 5 天固定 FSH 每日剂量。
研究方法有：
1、检测血清基础值
2、化学发光免疫分析仪（Architect i2000，美国）测定血清叶酸和VitB12水平（叶酸的LOD值和LOQ值分别是0.5ng/mL and 1.5ng/mL，VitB12的LOD值和LOQ值分别是125pg/mL and 150pg/mL）叶酸的检测上限是49ng/mL，有9例女性叶酸水平≥49ng/mL
3、原子吸收光谱方法（AA-7000 光谱仪，日本）检测血清钙和镁，所有样本均达到检测限，单位mg/L
4、计算钙镁比值（使用测量单位mg/L）
在行 IVF 方案之前的几周内收集血清，通过免疫法分析叶酸和维生素 B12 水平。对于钙和镁，采用原子吸收光谱法测定。
斯皮尔曼相关性分析微量营养元素和 ART 妊娠结局的关系
单一变量回归相关性分析显示基础 Vit B12 水平和 ART 没有相关性，镁和 ART 结局呈负相关；叶酸和 ART 结局呈负相关但无显著统计学意义；钙镁比值和 ART 结局呈正相关
这里我们描述我们的统计分析策略。首先，他们习惯于在对变量行回归和相关分析时，可以看到斯皮尔曼式的诱使预测变量和结果的相关矩阵。我们发现 B12 水平与 ART 结局无关。在数据上，镁和叶酸的结果都是，负相关的，镁的结果有统计学意义的，而钙与 ART 结局是多向的，和卵母细胞的结局无关，和临床结局有关。基于我们之前构建的多变量模型的完整分析，钙镁比和临床结局呈正相关，并有统计学意义。因此，我们特别关注叶酸和钙镁比，并将其作为预测因子。
多元回归模型
广义线性模型
泊松分布和对数连接函数——分析获卵数
二项分布和对数连接函数——分析妊娠结局
“核心”模型中的协变量(30 +)
● 年龄；BMI；不孕时间；不孕原因(男性/女性因素)；体外受精/ICSl尝试次数(1次或2次)；
● α促卵泡素(原始或生物仿制)；FSH刺激时间和剂量;促排卵扳机(GnRH-a或hCG);胚胎移植天数；
● 基础血清激素水平(AMH, FSH, LH,雌二醇,催乳素,睾酮）；基础血红细胞计数；
● 基础止血因子水平(APTT、抗凝血酶、国际标准化比率,凝血酶原)
● 对于每个结果，我们拟合一个完整的多变量模型，包括所有的协变量，对于该结果，单变量p≤0.20，并简化为一个保留协变量的最终模型，p < 0.05-0.10
● 如果变量将主要预测因子的回归系数改变10%，则保留在最终模型中。
我们使用了广义线性模型。我们使用泊松分布和对数连接函数建立广义线性模型分析获卵数。利用二项分布和对数连接函数分析怀孕和活产。我们的核心模型包含 30 多个变量的，列在幻灯片上。
基础血清微量元素水平
● 中位数血清叶酸浓度-20.55ng/ml（四分间距，IQR：10.8,32.9ng/ml）
● 中位数血清镁浓度-19.4mg/L（IQR：18.7,20.7）
● 中位数血清钙浓度-94mg/L （IQR：91.2,96.4）
● 中位数血清钙镁比值-4.78 mg/L （IQR：4.55,5.02）
● 中位数血清B12浓度-350pg/ml （IQR：239,471）
● 110名女性根据血清微量元素浓度被分为四个四分位数
在这里，你可以看到微量元素的每一个参数的水平，以中位数和积分率表示分布不是正态的。你可以看到叶酸和钙镁比例的直方图。当叶酸的中位数为 20.6 ng/ml 时，与 WHO 基于 Microcitic 和 emmieconcern 推荐的正常范围的上限相似。所有 110 名女性，根据血清微量元素的浓度被分为四个四分位数。
这是描述统计人数和各个参数的表格。研究的血清叶酸和钙镁比的四分位数，也允许通过使用非参数检验来检验差异。我们可以看到四组数据的特征是大致相似的。
这张幻灯片和接下来的五张幻灯片是基于最终调整后的多变量模型的六种结果中的每一种结果的许多数据。这是第一个结果：卵母细胞总数。我会详细描述这张幻灯片。这对理解后边使用类似结构的的幻灯片有所帮助。在顶部，您可以看到所有参与者的观察统计数据。我为所有的研究对象者取卵。幻灯片左侧显示了叶酸的四分位素。右边，是钙镁比值的四分位数。在表格上，你可以通过四分位数分布预测获卵数，并建设最终回归模型。我们发现了一个明显的趋势，预测获卵数从第一个四分位数的 13 个到高四分位数的 9个。获卵前钙镁比的情况也有相似性。
下一个结果是 MII 的成熟卵母细胞总数。所有女性的平均数接近 10。而叶酸为第 2、3 和 4 个四分位数，成熟卵母细胞的预测平均值低于第 1 个四分位数，但无统计学意义。对于钙镁比，成熟期或高四分位呈上升趋势，但也不显著。总之，为了建立卵母细胞结局的最终模型，我们校正和分析了 BMI、基础血清 AMH、APTT 水平、FSH 刺激时间长短和 FSH 剂量。
下一个结果是受精卵总数。在所有女性中，两个原核受精卵的平均数目为 8.7。我们发现与我们之前的成熟卵母细胞模型非常相似的结果。
在这张幻灯片上，你可以看到胚胎移植后 12 天有关生化妊娠的结果，是或否。在我们的研究中，36% 的妇女生化妊娠。因为这是一个二进制结果，是或否。我们使用第一个四分位数作为参考来计算比值比。对于叶酸，我们发现高四分位数的生化妊娠概率非常低。对于钙 / 镁比率，生化妊娠概率在更高的四分位数呈现出显著高可能性。
下一个临床结果是临床妊娠。与超声下移植胚胎 10 周后是否相关，是或否。我们的研究结果显示，30% 女性临床妊娠。我们再次发现来自叶酸最高的四分位的女性有临床妊娠率低，有统计学意义。对于钙镁比，我们可以清楚地看到高四分位数的女性有较高的临床妊娠率，显著相关。对于临床结局，包括临床妊娠模型，我们调整了血细胞技术和基础血清 FSH 浓度。
最后但并非最不重要的结果，就是活产率。 所有女性都移植了胚胎，25％的流产。对于叶酸，最明显的是活产的概率随叶酸的增加而变化的趋势，因为这是所有六个结果中最清晰的结果，钙镁比例的第三和第四个四分位数中有高可能性的活产率，有统计学意义。了解详细血清浓度区间有助于医生判断分析；校正 BMI、基础血清AMH 水平、APTT、刺激用药时间以及 FSH 剂量等协变量后，结果显示：不同分组的血清叶酸浓度和获卵数有明显统计学差异，且血清叶酸浓度的较高组获卵数越少、MII 卵数越少、受精卵数越少；而较低水平钙镁比值的女性获得成熟卵子数相对较少。校正过红细胞、FSH水平、钙镁比值后，血清叶酸浓度最高组（≥33.0ng/ml）较血清叶酸浓度最低组（≤10.8ng/ml）生化妊娠率（p=0.046）、临床妊娠率(p=0.02)及活产率(p=0.03)明显降低。
单次行新鲜胚胎移植的 IVF 治疗周期；排除内分泌疾病、病理情况、子宫内膜异位症 PCOS 及肥胖，且年龄在 20-35 岁的助孕女性；前瞻性研究；
局限性体现在：3 个认证临床实验室对叶酸、B12、钙、镁；由于样本量有限，未检测红细胞内叶酸水平；尚未评估饮食以及复合维生素和补充剂的代谢量；该研究样本量较小。
在非肥胖、促性腺激素正常且年龄在 20-35 岁的女性多变量因素分析模型中，高的基础血清叶酸浓度＞ 33.0ng/ml 与较差的 ART 结局相关（包括生化妊娠、临床妊娠及活产率）；低的基础血清钙镁比值和较差的 ART 结局相关，呈剂量依赖关系。
我们的发现可能有助于为正常受孕和正在进行助孕治疗的女性选择叶酸补充药剂的安全剂量。
此外还需要大规模的孕前研究来进一步验证，包括备孕夫妇所需的微量及非微量元素的水平，及每天使用剂量、血清叶酸、钙、镁、同型半胱氨酸及激素水平。
感谢所有参与数据采集和管理以及样本分析的人，感谢研究对象。
