Thomas Freour：教授，法国。
南特大学医院 ART 中心的负责人；UMR1064 研究团队的成员。
研究方向：胚胎学、延时治疗、卵巢储备、蛋白质组学和精子生理学。
简单地声明一下我的利益冲突。我是法国Nantes大学医院不孕科室的负责人，我在药学院工作，我们这里也有一个研究小组。除此之外，我还是Vitrolife公司的顾问医生。
这是我演讲的目录，在“一个简单的介绍”以及“TLT 的历史”之后。我将会向大家展示由 TLT 带来的关于受精、早期卵裂、桑椹胚、囊胚的新视角，并且我将会讲一点关于精准胚胎学的概念，我们也会讨论一些关于精子对于胚胎发育的贡献，思考延时摄像技术（time-lapse）在发育生物学领域的益处和关联，然后我将会做总结。
所以现在我们先简单的介绍一下。我们都知道，胚胎学的历史起源于动物模型，当人类胚胎学兴起之后，它主要基于静态的胚胎评估，并在几十年的时间里，评估人类胚胎发育的唯一方法是准时的，静态的在显微镜下评估。当然目前为止，人类胚胎的研究受到法律和伦理的限制，并且资源非常稀少。
这就是为什么当 TLT 在市场上出现时，在某种程度上，它是在临床领域和研究领域的双重变革。当然你也知道，延时摄像能够连续监测胚胎的发育并且提供稳定的培养环境，尽管它的临床作用在 Richard 的展示中仍然有争议，但这不是我今天演讲的主题。我想我们都同意它是一个可以提高我们对植入前胚胎发育的认识和研究的工具。这就是我们今天要讲的内容。
延时摄像技术（time-lapse technology, TLT）的特点和好处是什么呢？简单来说，和静态观察相反，TLT 可以实现对发育中胚胎动态的观察或者评估，这个发生在不间断的，稳定的培养环境中。此外，更确切的说，可以观察到之前不知道的细胞活动，包括早期的受精、卵裂、致密化、囊胚形成以及异常的卵裂模式。TLT 不仅可以观察细胞的发育，也是一个可以用于职工培训、质量控制及科学研究的工具，我们晚些时候会介绍科学研究这方面。
让我们回到延时摄像的历史，不是因为我是法国人（就说法国人好），而早期胚胎学领域的其中一位开拓者就是一位法国医生，叫 Jack Mulnard。在 1967 年，他发表了一篇报道，用英语讲就是“小鼠早期胚胎从细胞中期到囊胚阶段发育的电影摄影学分析”。之后同样的方法被进一步应用在牛的囊胚发育中。因此远在 50-60 年之前，延时摄像技术已经在动物模型胚胎学领域被我们的前辈所使用。
然后我们回到 1997 年，Ed Payne 和他的同事发表了关于 TLT 应用在人类胚胎的第一篇报道，并且被Thorir Hardason 2002年、Lemmen2008年的研究进一步强化。这些是TLT第一批关于在人类胚胎学的应用报告，但主要基于内置的延时摄像系统。
历史之TLT的现代时期
1997年之前，胚胎只在培养的第3天进行单点形态学评估
1997年之后，开始对胚胎进行持续观测
2011年开始使用人工算法评估胚胎
2020年，开始使用自动图像分析平台进行评估。
然后我们再转到更近的时间点，2011 年，现代延时摄像技术于 2011 年出现在市场上。2011 年，西班牙的 Marcos Meseguer 发表了第一篇关于现代延时摄像技术临床相关性研究的文章，这个时间点可被认为是 TLT 的新时代。
然后现在是 2020 年，我们正在迈向一个更新的时代，在这个时代里商业设备、TLT 设备使用了自动图像分析和人工智能。
所以现在我们更加深入地探讨 TLT能够做什么，以及它对于早期胚胎发育的观察能带来什么。首先，我们从受精开始，我将会只引用2个有趣的文章，一篇由Giovanni Coticchio在2018年发表，另一篇由法国的同行专家在2019年发表。而且这些文章应用了TLT来仔细地评估和研究非常早期的细胞活动和受精。比如，第一篇能够观察到原核的形成以及它的特点，它是在可能的地方识别来自雄原核的细胞质波。并且最后有证据表明细胞质晕和原核特点与第三天的胚胎质量相关。所以这是第一次从这些细节方面研究早期受精。
在那篇 2019 年的研究报道中，研究了大量的从受精到胚胎发育的第 2 天的细胞活动，并且他们发现，原核并列时原核的位置以及在 2细胞阶段多核分裂球的缺失可能和活产相关，需要注意的是我们这里讨论的主题不是临床结局，而是这些在受精阶段识别出特异早期细胞活动的非常有趣的工作。
早期卵裂的新视角之异常卵裂
-相对较高的患病率
-形态学上通常在第3天被认为可移植
-囊胚形成率低
-临床结果极差
需要进一步研究: 起源? 涉及的细胞和遗传机制是什么? 有改善的方法吗?
我们看一下受精之后的早期卵裂。很可能你们大部分人知道延时摄像，就像你们在屏幕的右侧看到的视频，它是一个非常好的监测异常细胞卵裂的工具。这些异常的卵裂，比如说，就像视频所示一个合子直接分裂成 3 个子细胞，这种情况的发生率很高。不能使用常规的静态形态学评分对他们进行评估。有趣的是，这些卵裂异常的胚胎形态通常适用于第 3 天的移植。得益于延时摄像，我们才能识别出它们。如果我们进一步研究这些有着异常卵裂胚胎的发育，它们的囊胚形成率低、临床结局极差。在我看来，通过延时摄像技术，可以进一步研究异常胚胎卵裂的来源是什么，并评估关于异常卵裂的那些假说。在里面涉及的细胞和遗传机制是什么？是否有其他的方法可以改善胚胎的发育、限制异常卵裂的发生率？这些有希望在未来的研究中被探讨。
多核化:流行率，可逆性和结果
多核在2细胞期胚胎是很常见的，在大部分胚胎中是可逆，不影响着床率
大多数MN胚胎具有自我纠正能力，能够早期分裂，并能发展成整倍体囊胚，从而发育成健康婴儿。
另一个可以使用延时摄像进行精准监测的早期细胞活动是多核化，而且在 2 细胞阶段胚胎的多核化是非常常见的。但是幸运的是它有很高的概率是可逆的，并且不影响普通的着床率，这个是不能被常规的静态形态学分级所察觉。第二篇文章是对第一篇文章的补充，就像你在这个第二篇文章中所看到的一样，大多数多核化的胚胎在早期的卵裂期可以自我纠正，可以形成一个最终能发育为健康宝宝的整倍体囊胚。所以长久以来，多核化被视为是低预后的标志，有可能是真的，但是只在保持稳定的胚胎中，尽管在很多胚胎中它是可逆的。
桑椹胚阶段
- 关于卵裂事件超过8细胞阶段的具体时间和/或致密化过程的动力学的数据很少
- 致密化可能发生在4细胞期和16细胞期之间的任何阶段(大多数胚胎由8细胞期开始)
- 早期致密胚胎:细胞周期异常、多核、成胚率差(Iwata et al.， 2014)
- 技术上讲，确定完全致密的时间是有挑战性的，因为它的动力特性，发生在几个小时之间
我们转到早卵裂期的下一步，桑椹胚阶段，这里有一篇很好的由 Geovanni Coticchio 和他的同事几个月前发表的综述文章，他们发现目前能够对 8 细胞以上卵裂期细胞活动和 / 或致密化过程的动力学进行特异性时间测定的数据很少。
事实上致密化可以发生在 4 细胞和 16 细胞之间的任何一个阶段，而大多数胚胎发生在 8 细胞阶段之后。为什么要监测致密化呢？有很多原因。
首先，早期致密化的胚胎被认为是和细胞周期异常、多核化、低的囊胚形成率相关。技术上讲，完全致密化时间的判定目前充满挑战，而延时摄像可以提供帮助。
囊胚期
- 致密化时间与囊胚发育和收缩模式的关系(Marcos等，2015)。
- 实验室操作如第三天的囊胚活检，对致密化的影响(Bar-El et al.， 2016)
研究表明，致密化、时间和囊胚发育之间存在着联系，不仅与囊胚发育有关，而且与收缩方式有关。有趣的是我们可以看到在桑椹胚阶段发生的细胞活动会和囊胚阶段发生的细胞活动相关，当然这是有道理的。
最后要说的是，各种实验室的操作比如第三天卵裂球的活检会影响胚胎的致密化。
最近在体内标记和 TLT 方面有一些新进展。我们来看看 TLT在临床之外的研究。在那些方面它是一个更加基础性的研究，但依然是基于延时摄像技术，他们扩展了我们对于致密化机制的理解以及其中关键性分子的作用。
在这里你可以看到一个非常好的例子，但遗憾的是这个视频不会暂停，如果你去 Nicolas Plachta 网站你可以看到关于延时摄像动态评估桑椹胚致密化的非常好的例子。
另外一个最近被提出的问题是一些非整倍体胚胎是否可以自我纠正，看起来桑椹胚是一个很好的在胚胎植入前胚胎质量的检查点，并且致密化可能被涉及在自我纠正的机制里。我鼓励你去阅读这篇有意思的文章，尽管他是一个基础研究。他是非常有趣、有前途的研究，整倍体囊胚可能来源于部分致密化、异常卵裂的胚胎。与滋养外胚层细胞相比，致密化过程中被排除的细胞在分裂过程中更容易出错，或者由于大量的DNA 降解而无法被分析。可能的假设是异常卵裂获得的非整倍体卵裂球在致密化阶段被排除掉了，你可以看这里和这里（见图中红色箭头所指的两处位置），这些非整倍体细胞被排除掉，从而实现在囊胚阶段胚胎整倍体的自我纠正。这些需要被进一步验证，因为它是非常相关的。
简单地讲一下，其实关于囊胚的发育有很多东西要说，TLT 能够监测它的动态特征，比如说囊胚的塌陷以及冷冻复苏后的形态学和动力学。总体来说，这些囊胚发育的动力学指标已经和临床结局、植入潜能相关。所以这个是非常相关的，未来需要被进一步确定。但是，很明显延时摄影不仅在早期发育而且在囊胚阶段、胚胎复苏之后都是非常有用的。
复 苏 之 后， 在 这 里 我 要 先 感 谢 一 下 我 的 朋 友 Marcos Meseguer。接下来，我要向大家推荐精准胚胎学这个概念，因为延时摄影不仅能够在精准的时间评估卵裂情况，而且可以对胚胎的发育进行精确的测量，比如说直径、内细胞团的面积。
另一个例子，是胚胎滋养层细胞的细胞周期长度。这个我不会详细的讲，你可以查看来自 Marcos 和 Larios 的文章并与他们交流。但是这就是一个 TLT 可以帮助我们研究更多关于植入前胚胎发育细节的例证。这是与去理解正在发生什么并且试图去改善非常相关的。
下面让我们转变一下，让我们来思考一下精子对于胚胎发育的贡献。当然我们不会从这里学到，你也不会因为精子带来 DNA、精子激活因子以及中心粒而感到惊讶，但是它也带来了各种类型的mRNA 分子以及表观遗传学标记，这里有很多的文章可以证明这个。在这里我想说的是延时摄影可能帮助我们了解精子 mRNA 对于胚胎发育的贡献以及精子发生、精子质量、男性不育症和进一步胚胎发育的关系，这是因为这些东西在目前为止很难被了解，尤其是精子的 mRNA、表观遗传学标记，而它们都在胚胎的发育中。所以我非常确信，TLT 将会帮助我们破译精子对于胚胎发育的作用。
当我们更加深入地去看发育生物学基础研究时，会再一次发现，这些只是例证。但是当然 TLT 可以帮助我们了解很多东西，特别是当它结合了其它的成像技术，比如说这里的共聚焦显微镜，展现了对细胞器动力学以及细胞骨架重组的新见解，对于了解细胞正在发生什么非常有用。
深入了解发育生物学：胞质运动
证明在减数分裂完成之前发生细胞质运动
由肌动蛋白运动驱动
详细了解完成减数分裂的物理机制
在 NCB 的另外一篇文章证明了细胞质的“流动”在减数分裂之前发生，并且是被肌动蛋白运动所驱动的。当然如果你想要了解发生在减数分裂过程中的物理机制，延时摄影是非常准确的。我认为大家都了解正在发生什么。
延时摄影可以进一步和胚胎发育的代谢评估相结合。因此在这里你可结合 NADH 和 FAD。
代谢的非侵入实验图片
结合成像和新陈代谢
NADH水平的FLIM成像
线粒体蛋白酶缺陷的小鼠NADH升高
结合技术的可能性
这里也是相同的，使用基于 NADH 水平的 FLIM 成像技术。你不仅可以使用延时摄影连续地观察胚胎发育，而且也可以观察代谢。当然这种结合不同技术去评估胚胎发育的可能性是非常有意义的。再举另外一个例子，当你研究小鼠的发育，你以“天”为单位进行计时，第一天、第二天、第三天，这是因为这些胚胎是非常稳定的，它们总是以相同的方式进行发育。但是对于人类胚胎，不能再以“天”记，它是按照发育阶段进行的。因为 B2 阶段在不同胚胎不一定发生在同一时间。
延时摄影对胚胎进行分期是非常有用的，因为不是所有的胚胎在同样的时间都有 B2 阶段的发生，这是我们团队在制定出一个基于单个细胞 RNA 测序的人类线性说明模型时所使用的。在这里你可以看到处在不同阶段的胚胎（A 图），它们的时间在这（F 图），以及不同目标的图像和伪时间构建去例证基于胚胎发育阶段的 RNA发育速度。
最后要讲的是 TLT 的未来，以及它关于胚胎发育令人充满希望的见解。我指的是人工智能，并且上个月有很多相关的文章被发表，并且我不会对“TLT 和人工智能的结合会在我们致力的胚胎发育方面带来更多见解”这一点感到惊讶。
总结：
- TLT的临床疗效仍存在争议
- 但是TLT可以详细深入地分析胚胎在所有阶段的发育情况
- 易于与其他非侵入性方法结合使用
- 基础和临床研究的相关资料
- 为更好地理解人类胚胎学铺平了道路
- 最终提高体外受精的临床效果…
总结一下，尽管 TLT 的临床获益目前仍备受争议，这不是我今天演讲的目的，但是希望我能让你相信 TLT 能够让我们更加细致地、深入地对各个阶段的胚胎发育进行分析。很容易结合其他非侵入性的方法。对于基础和临床研究来说它都是一个非常有意义的工具，而且它为更好地理解人类胚胎学打下了基础，而在这里还有好多的工作需要去做，我们应该对能够拥有这样一个非常有意义的工具心存感激，并且最终它可能帮助我们改善IVF的临床结局，我们会在将来看到这一点。
