Myrthe Smits：
医学博士，生殖医学，阿姆斯特丹大学医学中心，荷兰。
临床医生和研究员；
研究方向：妊娠减少和卵巢衰老。
女性成功的妊娠很大程度上取决于女性的年龄。这就是我们所说的卵巢衰老的现象。我通过这两个图表来给大家举例说明。左图显示了使用自身卵子或赠卵进行ART治疗的患者，每ART周期的妊娠率。x轴是女性的年龄，这条实线代表使用自身卵子的女性，我们可以看到，随着女性年龄的增长，每ART周期妊娠率下降。当这些女性接受相对年轻供卵者的卵子时，年龄影响就会减弱。且对妊娠丢失率的影响是一样的。右图所示，x轴是女性的年龄，y轴是每次妊娠的自然流产率。这些都是进行ART治疗的女性。实线代表使用自己卵子的女性，而虚线代表接受赠卵的女性。我们可以看到，在35岁之后，接受自己卵子的女性妊娠丢失的几率会迅速增加。而当他们接受了赠卵后，年龄的影响就消失了。所以我们想知道，年长女性的卵子和年轻女性的卵子有什么区别?此外，卵子的质量是如何随着女性年龄的增长而下降的呢？
大多数关于卵巢衰老的研究都是使用治疗后或排卵后的卵母细胞。这些在这幅图中都有体现。但我们研究更关注的是原始卵泡。
图中圈起来的这些就是原始卵泡。原始卵泡在卵巢中处于休眠状态，直到它们受到刺激为排卵做准备。这个过程可能需要 40 多年的时间。在这段时间里，它们会暴露在很多环境因素中，比如活性氧自由基。这些氧分子很容易与其他分子反应，并由此造成损伤。所以在这段时间里，当它们暴露在大量 ROS 中，就可能会降低卵母细胞的质量。
因此，我们的假设是，卵母细胞质量的下降是由活性氧自由基（简称 ROS）引起原始卵泡损伤造成的。
实验对象：年龄分组18-29年龄段（n=9）,30-34年龄段（n=10）；35-39年龄段（n=8）；40-45年龄段（n=12），卵巢组织石蜡切片。
实验步骤：
1.苏木精染色识别卵泡发育阶段。
2.不同抗体染色，证明ROS诱导卵泡各个部分损伤
3.NTY染色蛋白质、4-HNE染色脂质和8OHDG染色DNA
氧化磷酸化：TOMM20染色线粒体；PHDA染色氧化磷酸化。
为了验证这一点，我们收集了以往在手术中切除的卵巢进行活检。我们收集了不同年龄段女性的卵巢组织切片，这些切片显示了卵子质量随年龄增长而逐渐下降。我们的年龄分组为：最年轻的 18 - 29 岁，之后是 30 - 34 岁，35 - 39 岁，40-45 岁。组织切片是用石蜡包埋的，每个年龄组收集的切片数量在这里，用橙色字体表示，每个年龄组大约是 10 块。我们进行了活检，想知道组织切片中是否有卵泡。因此我们做了苏木精染色来识别不同的卵泡和卵泡形成的不同阶段。稍后会有一张照片展示给大家。当我们完成了卵泡的识别时，我们想知道，是否能在切片上发现 ROS 引起的卵泡（尤其是原始卵泡）损伤。ROS 能破坏细胞的不同成分，如蛋白质、脂质和DNA。所以，如 PPT 右侧所示，我们用不同抗体，为 ROS 所诱导的不同细胞成分的损伤染色。当我们证实存在 ROS 损伤时，我们想知道 ROS 是从哪里来的 ? 而最广为人知的产生 ROS 的途径是通过线粒体。因此，我们需要对线粒体进行染色，但染色不仅是为了查看线粒体是否存在，还要看卵泡是否能利用线粒体。为此，我们进行丙酮酸脱氢酶染色，丙酮酸脱氢酶能将丙酮酸转化为乙酰辅酶 A，然后进入柠檬酸循环，造成活性氧自由基损伤。所以我们用丙酮酸脱氢酶染色来确定卵泡是否已经能够进行氧化磷酸化。
原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，三级卵泡
Gr=颗粒细胞，Th=膜细胞
这里展示了我们在活检中发现的卵泡发育的不同阶段的照片。如前所述，我们最感兴趣的是原始卵泡阶段。原始卵泡可由被单层扁平的颗粒细胞包围着的卵细胞而得到识别。当原始卵泡被刺激时，这些颗粒细胞变得与外界更加隔绝，这就是我们所说的初级卵泡。当有多层的颗粒细胞时，我们称之为次级卵泡。在我们的活检组织中观察到的卵泡发育的最后阶段为三级卵泡。此时不同分层的颗粒细胞之间开始出现充满液体的腔隙。所以当我们可以在活检组织中找到卵泡时，我们回溯到原始卵泡，想要确定那里是否有ROS引起的损伤。
结果：ROS在原始卵泡中诱导损伤蛋白，脂质，DNA
标尺：20微米；Noo=核细胞，Gr=颗粒细胞，Th=膜细胞，蓝色=DAPI染色核细胞，红色=ROS诱导损伤位置
这些是我们做的免疫荧光的图片。蓝色的是 DAPI 染色，显示细胞核。你可以看到中间是卵母细胞的细胞核。卵母细胞的细胞核被颗粒细胞的细胞核所包围。红色部分是ROS对蛋白质、脂质和DNA的损伤。这里你可以看到在原始卵泡中有ROS诱导的蛋白质、脂质和DNA损伤。但我们想知道这种损伤是否也随着女性年龄的增加而增加。为此，我们测量了不同年龄组的抗体最大荧光强度。
这些图展示了蛋白质、脂质和 DNA 损伤在不同年龄组的抗体的峰值强度。可以看到，蛋白质和有限的脂质损伤随着女性年龄的增长而增加，而 DNA 损伤随年龄增长似乎没有改变。所以我们推测 DNA 在某种程度上受到保护而免受 ROS 诱导的损伤。蛋白质和脂质损伤随年龄增长而增加约 50%。
结果：线粒体和丙酮酸脱氢酶 Noo=核细胞，Moo=线粒体核，Gr=颗粒细胞，Mgr=线粒体颗粒细胞，Th=膜细胞，红色=线粒体，黄色=PDHA(脱氢酶)，蓝色=DAPI
染色核细胞，绿色=WGA
因此，当我们在特定损伤中识别了 ROS 后，我们想知道诱导损伤的 ROS 来源。为此，我们回到了卵泡发育的不同阶段，对线粒体及有生物活性的脱氢酶染色。这张PPT，大家可以看到蓝色的是DAPI染色，绿色的边界显示卵母细胞周围的颗粒细胞，黄色的是丙酮酸脱氢酶，红色的是线粒体染色。如果你仔细放大来看，你会看到所有的黄色同时也有红色沾染。如果你就只看到黄色，这实际上也还是线粒体与丙酮酸脱氢酶在一起的染色。我们发现在卵泡形成的所有阶段，都有线粒体，也有丙酮酸脱氢酶，这给了它们进行氧化磷酸化的能力。
综上所述，我们已经证明，原始卵泡已经存在活性氧自由基（ROS）诱导的损伤，并且ROS诱导的蛋白质和脂类损伤似乎随着女性年龄的增长而增加。我们发现ROS可能来自于氧化磷酸化，因为在原始卵泡中存在丙酮酸脱氢酶。实际上，这在卵泡形成的所有阶段都存在。我们在这里使用的技术难以进行统计学分析。但我认为，我们的研究表明，未来的研究不应该只关注排卵后的卵母细胞，还应该关注原始卵泡，特别是有关ROS和氧化磷酸化活动的研究。
