不孕症患者数量的增加使得辅助生殖技术(assistedreproductive technology,ART)飞速发展，现胚胎移植技术及促排卵方案不断改进与完善，体外受精-胚胎移植(invitro fertilization -embryo transfer,IVF-ET)妊娠成功率已提高至40%~60%1,其中高龄女性IVF-ET成功率明显低于年轻女性²。由于IVF-ET过程中患者需经历降调期、多次进行超促排卵及人工取卵操作，会导致肾中精气受损，优质卵泡数量减少，IVF-ET助孕结局仍较差。因此如何提高卵泡数量及质量、提升IVF-ET妊娠成功率，始终是生殖医学界的难题。《灵枢·经脉》云“人始生，先成精”,指出生命的起始在于父母生殖之精的结合，生殖之精的作用与现代医学所讲的“精原细胞、卵母细胞”类似。中医认为不孕症患者病位在肾，病性属虚，治疗不孕主要从补肾入手。在“肾主生殖”理论的指导下，中医药运用补肾法干预IVF-ET,分期论治，整体调节，有效改善IVF不孕症患者的卵泡数量及质量，提升了IVF-ET的成功率，弥补了现代生殖医学的不足。现对近年来补肾法在IVF-ET中调控卵泡数量及质量的相关文献进行了归纳整理，旨在总结阐述补肾法在此领域的应用及研究概况，以期为今后中医药干预辅助生殖治疗不孕症提供一定的参考。
1基础研究应用
1.1调节卵巢局部因子
佟雪等34研究发现补肾调经系列方可促进控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)小鼠卵丘-卵母细胞复合体的卵丘扩展，通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路、上调卵丘扩展相关因子透明质酸合酶
2、肿瘤坏死因子α刺激因子-6表达从而促进小鼠卵母细胞成熟。骨形态发生蛋白-15(bone morphogeneticprotein-15,BMP-15)是预测卵母细胞质量的重要指标之一，白静等3研究证实补肾法可增加COH小鼠的排卵数和优质卵泡数，其作用路径可能是调控卵母细胞中BMP-15的表达。段彦苍等6先后通过实验表明，补肾调经方可提高小鼠卵母细胞分泌因子生长化因子-9、BMP-15 mRNA及其蛋白表达促进其卵母细胞成熟；还可调节排卵乏氧微环境，调控孕激素受体A及其下游的缺氧诱导因子-1α mRNA、血管收缩剂内皮素2 mRNA及其蛋白表达致卵泡顶端血管收缩；此外还能上调去整合素-金属蛋白酶8(ADAM8)、I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1)蛋白及mRNA的表达，增强ADAM8和ADAMTS-1的蛋白溶解作用致卵泡壁易于破裂，从而诱导排卵的发生。卵泡的产生与排出受卵巢多种因子共同调控，补肾法可通过调控小鼠卵巢相关因子，促进卵泡发育并成熟。
1.2影响卵巢组织形态学
研究发现，补肾调泡周期疗法组方(逍遥散、三子汤)可上调大鼠原代卵巢颗粒细胞抗苗勒氏管激素(anti-Mallerian hormone,AMH)、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体、Smad同源物4蛋白、mRNA表达及AMH、雌二醇(estradiol,E₂)、孕酮(progesterone,P)的合成与分泌，促进卵母细胞增殖、发育与成熟，改善卵巢生殖和内分泌功能。赵井苓等"通过实验研究发现补肾活血方可增加卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)大鼠卵巢组织中血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)及PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达，下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)含量，增加卵泡数量。王昭等¹通过建立雷公藤多苷诱导的DOR模型大鼠，研究补肾养精汤对DOR模型大鼠卵巢储备功能的影响，结果发现应用此方大鼠促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)含量降低，E₂、AMH含量升高，卵泡和颗粒细胞层数增加，自噬溶酶体减少，提示补肾养精汤可促进大鼠卵泡发育，改善其卵巢储备功能。庾敏姬等³为研究补肾填精法对小鼠原始卵泡发育的作用，将小鼠随机分为卵巢早衰模型组与中药组，中药组予补肾填精法治疗，结果显示中药组小鼠骨形态发生蛋白4、Smad同源物1、bHLH转录因子2及干细胞因子蛋白表达、原始卵泡和初级卵泡数量明显增加(P<0.05),原始卵泡中卵母细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。宋翠森等4)研究发现COH过程会影响小鼠内源性激素平衡，使P水平异常升高而卵泡数减少，其卵巢储备功能明显降低，故通过设立COH模型组、补肾组与正常组小鼠，观察补肾调经方对COH小鼠卵巢功能的影响，结果显示补肾组小鼠P水平明显降低，卵巢有较多次级卵泡和少量初级卵泡，可见黄体，白血病抑制因子表达明显升高，证实了此方有改善COH小鼠卵母细胞发育潜能，促进卵泡发育、成熟以及调节内源性激素的失衡及卵巢储备功能的作用。补肾中药可调节小鼠体内激素的失衡，改善卵巢功能，增加卵泡数量。
1.3调控卵母细胞线粒体
范丽洁5通过实验发现补肾法可提高卵母细胞内蛋白激酶C表达水平，激活核因子E2相关因子2(Nr2)基因转录，提高Nr2蛋白活性，诱导Nr2信号通路下游抗氧化酶基因表达，进而提高卵巢抗氧化酶活性、卵母细胞抗氧化能力及其线粒体功能。杜惠兰等[¹-4经动物实验发现补肾调经方可增加小鼠卵母细胞线粒体DNA拷贝数、解偶联蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α、缝隙连接蛋白Cx37和Cx43蛋白表达水平，增加Cx数量；通过上调超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶活性及表达，提高卵母细胞抗氧化能力，保护线粒体结构与功能；还可调控卵丘颗粒细胞凋亡调控基因Bcl-2/Bax表达水平，降低卵丘颗粒细胞凋亡率。线粒体是卵母细胞的重要器官，参与其能量代谢，线粒体能量活动与卵母细胞发育成熟及排卵过程密切相关。补肾法具有改善卵母细胞中线粒体形态及功能、抗细胞氧化、降低细胞凋亡率等作用。
2临床研究应用
相关研究表明，不孕女性卵子质量低于常人¹⁹,补肾调周法可以增加不孕症患者排卵数进而提高临床妊娠率[20。还有Meta分析发现补肾法临床干预IVF患者可有效提高其获卵率及hCG日E₂水平，也为临床上运用补肾法促进IVF患者排卵、提高妊娠成功率提供了理论支撑。“种子必先调经”“男精壮而女精调，有子之道也”“经水出诸于肾”,指出女子月经的产生与肾密切相关，故中医治疗不孕首要任务是补肾调经，如郑惠芳教授主张治疗不孕症应以补肾调经为主²¹;邓高丕教授治疗不孕女性排卵障碍与卵泡质量差，常采用固摄肾气的中药以培本[24。基于上述观点，现代医家常在IVF患者进入周期前补肾培元，以弥补其先天不足，如蔡连香教授认为不孕症主要病机为肾精不足，应以补肾填精为治疗大法，在IVF-ET周期启动前及取卵前预先调理3-6个月经周期l²;匡继林教授主张IVF-ET患者在进入周期前3个月开始调理，非经期以滋阴补肾、活血调经为主，经期以清热解毒、活血化瘀为主2。进入周期后顺应不同时期需要：降调期机体激素水平低下，常见潮热、盗汗、性欲低下、失眠等肾阴虚证，治疗常以滋阴安神为主，并认为降调期应改善宫腔环境，常以活血化瘀为主，辅以健脾疏肝、清热安神；卵泡期为卵泡发育及IVF是否成功的关键时期，肾之精气充盈、气血调和是卵泡发育良好的前提，此时宜补肾滋阴、养血填精助卵泡生长；排卵期阴阳转化之时宜补肾活血行气助卵泡排出，如牛建昭教授此时期用药以疏肝行气中药为主，辅以针刺子宫、关元、三阴交、血海、太冲、合谷等穴位，促卵泡成熟并排出27。
2.1中药内服
2.1.1补肾填精、滋阴助阳 王晓甜28通过回顾性研究证实补肾填精法治疗能提高DOR/早发性卵巢功能不全/月经后期患者月经规律率及闭经患者月经回潮率，降低FSH水平，提高AMH及窦状卵泡数水平。连方等29通过研究证明二至天癸颗粒(枸杞子、菟丝子、女贞子、早莲草等)能改善IVF-ET患者的肾虚症状，以及卵巢对促排卵药物的反应性，增加排卵数，提高卵泡质量及可利用胚胎率。还有研究显示右归胶囊能够改善高龄肾阳虚IVF-ET患者肾阳虚症状，并可通过络氨酸激酶2/信号传导及转录激活因子3(JAK2/STAT3)通路上调SOD、JAK2、细胞周期蛋白D1表达水平提高其卵母细胞质量，改善助孕结局[。蒋晓梅等研究发现，补肾育胎方(熟地黄、黄芪、女贞子等)可提高行IVF-ET肾气虚证不孕患者激素水平，改善胚胎质量，增加优质胚胎发育可能。郭银华等发现应用补肾促排卵汤(鹿角片、山萸肉、川续断、菟丝子等)干预IVF-ET助孕的多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)肾虚证患者，可使PCOS肾虚患者的基础内分泌激素水平及卵母细胞质量均提高。李娜等研究发现补肾调经汤(菟丝子、山药、炙黄芪、补骨脂等)可提高IVF患者窦状卵泡数、卵巢动脉的血流速度及性激素水平，后经临床研究证明补肾调经方可以增加IVF患者卵泡对外源性促性腺激素的敏感性，提高患者受精率及优质胚胎率[69。“肾为水火之宅”,肾精化生卵泡，肾气化生天癸，依赖肾之阴阳的协同促进。中医认为“氤氲之时”即阴阳转化之时为种子最佳时机，肾阴和肾精的生化和滋长是卵泡发育的物质基础，肾阳和肾气的鼓动是卵子生长发育和排出的动力，肾精或肾气不足则卵泡发育异常，故对于不孕患者卵泡的调控常以填肾精、补肾阳、滋肾阴为主。
2.1.2补肾活血 研究证明养巢增膜汤(菟丝子、丹参、当归、熟地黄等)可明显改善高龄不孕女性患者的肾虚血瘀症状，还可以降低其血清FSH、LH水平，增加其窦卵泡数量，从而促进机体排卵，增加获卵数40]。宋俏蔚等4采用补肾活血调周法治疗反复IVF-ET失败患者，结果显示患者血清FSH水平明显降低、窦卵泡数量明显升高。吴艳婷 在对照组促性腺激素释放激素短效长方案的基础上给予观察组加服补肾益气和血法中药(黄芪、菟丝子、当归、熟地等),研究该方对IVF患者卵泡的影响，结果显示观察组患者卵泡液胰岛素样生长因子2、白介素6、VEGF水平升高，肿瘤坏死因子-α水平降低，说明补肾益气活血中药可以促进卵泡发育、提高卵母细胞质量。丁泓玉通过临床研究证明肾虚血瘀型DOR不孕症患者在微刺激方案促排前3个周期开始口服补肾活血方(覆盆子、枸杞子、菟丝子、红花、桃仁等),可增加优质胚胎率和临床妊娠率。李芊芊4通过临床研究证明二至天癸合祛瘀解毒方(女贞子、墨旱莲、川芎、当归、生地、大血藤等)可抑制肾虚血瘀型IVF-ET周期子宫内膜异位症不孕患者caspase-3蛋白表达，减少凋亡信号的传导，降低颗粒细胞凋亡率，进而提高卵母细胞的质量。牛小露45通过研究发现，补肾活血方(熟地、白芍、山萸肉、赤芍、丹参等)对卵巢低反应患者生殖轴起良性调节作用，可有效降低FSH水平、FSH/LH比值、E₂水平，使AFC增多，从而改善卵巢储备，提高排卵率。
肾气充，天癸至，气血运行通畅，适时而泄，形成排卵。肾气不充，冲任不调，气滞血瘀，卵子排出受阻，治以补肾活血，故补肾同时也应酌情增加活血通络之品促卵泡排出，如当归、川芎、桃仁、红花等。
2.1.3补肾化痰 洪艳丽等14经研究表明，IVF治疗前口服补肾化痰方(淫羊藿、仙茅、苍术等)3个月可调整超重/肥胖PCOS患者卵巢局部代谢通路，提升卵泡发育潜能，进而提升囊胚形成率以及临床妊娠率，改善IVF-ET结局。连方等47采用二至天癸合启宫丸联合达英-35治疗PCOS肾虚痰湿不孕患者33例至hCG注射日，发现治疗后患者中医证候积分、胰岛素抵抗指标显著降低(P<0.01),卵巢颗粒细胞磷酸化蛋白激酶B、葡萄糖载体蛋白4表达升高(P<0.05),提示二至天癸合启宫丸不仅可以改善PCOS患者肾虚痰湿症状，还可以改善其胰岛素抵抗，上调卵巢颗粒细胞相关蛋白表达，提升卵泡发育潜能。中医认为PCOS的主要病机是肾虚为本、痰湿为标，湿聚成痰，阻遏气机，瘀滞胞宫，则卵巢排卵受阻，诱发不孕，因此治疗PCOS型不孕常以补肾化痰为主。
2.1.4补肾疏肝 尹芳研究发现补肾疏肝方能明显降低肾虚肝郁型卵巢储备功能下降患者FSH、LH数值及FSH/LH比值。张争等应用疏肝补肾中药(柴胡、香附、旱莲草、淫羊藿、菟丝子等)辅助治疗DOR患者进行IVF-ET,结果显示用药后患者性激素水平、获卵数及可移植胚胎数均有提高。《济阴纲目求子门》云：“女性多气多郁，气多则为火，郁多则血滞……生育之道遂阻也。”指出妇人易受情志困扰，加之大多数不孕患者求子心切，易致肝气郁结，气血失和，冲任失养，故在补肾同时还应辅以疏肝之品，调气和血。
2.1.5补肾健脾 郑惠芳教授认为高龄女性不孕，病位在卵巢，采用补肾健脾中药(党参、桑寄生、菟丝子、白术、山药等)联合拮抗剂方案促进高龄IVF-ET妇女排卵，结果显示补肾健脾法可增加高龄IVF-ET妇女的优质胚胎数。李晶等S采用补肾健脾中药内服干预
高龄冻融胚胎反复移植失败患者3个月后再行IVF治疗，观察其胚胎质量的改善情况，结果显示中药干预过后患者优质卵率、优胚率均高于未经中药干预的对照组(P<0.05)。张越等运用补肾健脾加减方(生地黄、熟地黄、淮山药、山萸肉、丹参等)联合芬吗通治疗DOR患者，服药3个周期后患者FSH值、E₂值、LH值均较前下降，基础窦卵泡数较前增加，胚胎种植率、临床妊娠率
提高(P<0.05)。脾为后天之本，气血生化之源，不孕患者IVF超促排卵后的病机多为脾肾两虚，因此对于高龄不孕患者宜先后天同补。
2.2穴位刺激
研究显示，针刺可以有效改善DOR患者的卵巢储备功能，调节生殖内分泌及促进排卵5]。兰颖等5发现在促排卵过程中给予安神补肾针灸干预，可促进卵泡发育，提高受精率和优势胚胎率。蔡靓等⁵应用补肾健脾针刺法治疗行IVF-ET的不孕症患者，发现针刺可促使患者排卵。宗道宽将134例IVF卵巢低反应患者随机分为针刺组与对照组，均采用温和方案促排卵治疗，针刺组于促排卵治疗前1个月先行针刺治疗1个月，每周不少于3次，结果显示，针刺组患者治疗后FSH水平低于对照组及针刺治疗前，针刺组治疗后获卵数及优胚数均高于对照组(P<0.05),提示“补肾调冲”针刺法可改善卵巢低反应，改善妊娠结局。黄德清将66例肾虚肝郁拟行IVF-ET患者随机分为治疗组及对照组，均采用西医促排卵改良方案，治疗组患者在hCG日前，每日1次加以安神补肾疏肝针灸治疗，结果显示治疗组促排天数时间少于对照组，卵泡增长速度高于对照组，证实安神补肾疏肝针灸能加快卵泡发育成熟速度。还有研究表明经皮穴位电刺激/电针可上调IVF-ET患者血清及卵泡液中脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor,BDNF)的表达，促进颗粒细胞增殖、改善卵巢微环境，还可以调控卵巢颗粒细胞Wnt通路，上调通路中关键因子β-catenin蛋白的表达，说明穴位电刺激法对患者卵母细胞质量、受精率及优胚率均有提高作用]。“耳者，肾之官也”“肾气通于耳”指出肾与耳关系密切，故耳穴贴压可应用于妇科疾病的治疗；艾叶可温经散寒，通过艾灸任督二脉之穴亦可发挥补肾调经助孕之效。文怡等0采用王不留行耳穴贴压(选穴：肾、卵巢等)加予艾灸(选穴：关元、神阙等)可促进肾阳虚患者排卵。周睿]运用补肾调周法配合针刺及耳穴治疗排卵障碍性不孕患者后，其优势卵泡最大直径、周期排卵率均显著增加。穴位贴敷具有皮肤和穴位双重刺激功效，作为中医特色外治法之一，在临床应用较为广泛。于玲玉²通过研究得出穴位贴敷干预痰湿型PCOS患者能够增加其获卵数，可有效改善临床症状及IVF助孕结局。经络腧穴是人体精气运行的通路，通过穴位刺激可调节经络气机，平衡脏腑阴阳，其作为治疗女性不孕疾病的辅助手段效果显著。
2.3内外同治
吴彦辉等用补肾宣郁法(杜仲、熟地黄、苑丝子、柴胡、白芍等)配合指针疗法(嘱患者在家自行指针按摩疗法)治疗1例反复移植失败患者3个周期，治疗后该患者FSH数值较前降低，再次行IVF-ET治疗并成功妊娠。孙振高等4采用针药结合法对行IVF-ET患者进行干预，发现补肾疏肝中药(二至天癸颗粒和逍遥丸颗粒)结合针刺疗法可缓解IVF-ET患者焦虑、抑郁等不良情绪，明显提高优卵率、优质胚胎率及临床妊娠率。夏宛廷等运用中医药分步治疗助孕失败后再次拟行IVF-ET长方案助孕的肾虚肝郁血瘀型患者137例，分为治疗组72例、对照组65例，再次助孕前对照组自然等待3月，治疗组予中药口服+耳穴贴压+中药保留灌肠预处理3月；进入助孕周期后，对照组予常规降调、促排，治疗组则加以中药口服+耳穴贴压+中药保留灌肠，结果显示治疗组在提高获受精卵数、受精率及获新鲜胚胎数方面均优于治疗前及对照组(P<0.05)。马玲等“通过临床试验研究发现采用经皮穴位电刺激疗法结合补肾活血中药治疗卵巢储备功能低下患者，可提高患者FSH、E₂、AMH水平、基础窦卵泡数量及临床妊娠率。不孕症患者常常需重复进行IVF过程来增加成功概率，这也使得备孕周期延长、患者焦虑情绪增加，故IVF患者肾虚多伴气郁，内外同治法在一定程度上可减少患者心理负担。
3小结与展望
随着ART的进一步发展，如何获取更多优势卵泡、提高优质胚胎率的研究日趋深入，但为提高妊娠成功率，临床多次重复进行人工促排、取卵等操作，这对患者卵巢功能的影响和容易引起多项并发症的问题逐渐凸显，中医药治疗具有多靶点、多中心、不良作用少、价格接受度高等优势。经过分析总结，得出中医药应用补肾法调控卵母细胞数量及质量干预IVF-ET方式多种多样，有中药内服、穴位刺激、内外合治等，其中中药内服法根据患者不同病机加以益精、滋阴、助阳、活血、健脾、化痰、疏肝等不同治法，中医外治法有针刺、电针、艾灸、穴位贴敷治疗、耳穴贴压等，可见从肾论治可有效改善患者的临床症状、提高患者排卵率及受孕率。肾为先天之本，主生殖，在此理论的指导下，中医补肾法在IVF-ET助孕过程中已取得良好成效，如助孕前整体调节改善卵巢功能提高卵泡质量、进入辅助生殖治疗周期后提高子宫内膜容受性及胚胎着床率、促进胚胎发育降低自然流产率、降低并发症发生率等。
由于不孕症临床辨证分型及用药种类繁杂，中医药辅助生殖各家治疗方案也各有差异，目前IVF-ET过程中不同阶段的补肾法还无标准化统一分类，故难以进行大样本、多中心、系统化的研究。今后关于中医药辅治IVF-ET的过程中，应着重研究各种干预方式在IVF-ET进程中的作用机制，才能更好地体现中医药与现代辅助生殖技术结合的应用价值。
