近年来,随着中国女性实际生育年龄的推迟、“二孩”和“三孩”政策的逐步放开及社会再婚比例的提高,有正常生育要求的高龄女性比率也日益上升。然而,随着女性年龄的增长,卵巢储备功能、各级卵子数目及子宫内膜容受性会逐步减低,卵母细胞非整倍体率和生殖道肿瘤的发病率会逐渐升高不孕症在有生育需求女性中的发生率逐渐上升。1958年,国际妇产科联合会将生育时年龄在35岁以上的女性定义为高龄产妇。2019年,中华医学会生殖医学分会建议,从卵巢储备功能减退(DOR)的角度来定义“高龄”,这包括基础卵泡刺激素(bFSH)、基础雌二醇(bE2)、基础卵泡刺激素/基础黄体生成激素(bFSH/bLH)值升高、抗缪勒管激素(AMH)下降及窦卵泡数(AFC)减少,而不仅限于女性的实际年龄。研究发现使用辅助生殖技术(ART)来实现妊娠的女性,年龄每增长1岁,妊娠率就会减少6%。根据年龄的不同,DOR的发生率在6%~64%,这类患者在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中,出现卵巢低反应(POR)的可能性增大,导致受精和减数分裂异常的发生率明显升高,进一步降低了妊娠率”,因此被称为低预后患者。改善卵巢功能,提高IVF-ET的成功率,甚至帮助患者自然受孕，是拟再次接受IVF-ET辅助妊娠低预后患者亟待解决的问题。

        在中医典籍中,没有与DOR或POR相关的疾病名称,但可以根据其临床表现分类为“月经后期'月经过少”“闭经”“不孕症”等。近年来IVF-ET的低预后现状引起了中医药领域的广泛关注，对IVF-ET低预后患者采用中医药辨证论治,发现中医药治疗有效改善了IVF-ET低预后患者的卵子数量和质量,提高了胚胎着床率和临床妊娠率。

        拮抗剂方案是目前IVF-ET控制性超促排卵方案中常用的方案之一,但其新鲜胚胎周期移植率和临床妊娠结局并不理想,有关中医药介人干预低预后IVF-ET拮抗剂方案的研究报道也较为少见。笔者导师曾倩教授长期致力于中医妇科的临床研究,从整体出发,以中药汤剂口服、耳穴贴压、补肾活血方导法等途径为法,对行IVF-ET失败的低预后患者进行辨证论治,取得了良好的疗效,但是目前尚缺乏系统的临床研究与总结,因此,本研究着重于运用中医学的整体观念、辨证论治、综合治疗、阴阳调和等方法,对拟再次接受IVF-ET拮抗剂方案，且中医证候为肾阴虚肝郁血察的低预后患者进行干预,期望改善低预后患者的卵巢功能,提高其临床妊娠率和活产率，甚至使部分患者在再次行IVF-ET前成功自然受孕。

1资料与方法

1.1研究对象根据统计学公式n=

        计算纳人患者例数，设定α=0.05,β=0.20,Q1=Q2=0.50，πc=Q1π1+Q2π2,,同时考虑脱落率≤20%,故每组最少样本量为48例。本研究已通过成都中医药大学附属医院伦理委员会审批,批件号2020KL-027:并在中国临床试验注册中心进行国际注册中国临床试验注册号ChiCTR2000038229。

        选取2020年8月至2023年2月在四川大学华西第二医院就诊,计划再次接受IVF-ET拮抗剂方案的184例肾阴虚肝郁血证低预后患者,评估后排除56例，最终纳人病例128例，按随机对照表分为观察组和对照组,每组各有患者64例,观察组在成都中医药大学附属医院妇科门诊接受多途径的中医药干预。对照组因放弃妊娠脱落2例(3.1%),剔除0例(0%)完成62例(96.9%):观察组因放弃妊娠脱落1例(1.6%),因依从性差剔除2例(3.1%),完成61例(95.3%)。见图1。两组患者用药前基线资料比较,差异均无统计学意义，资料具有可比性见表1。

1.2诊断标准

        1.2.1波塞冬标准2016年,欧洲生殖和内分泌专家委员会根据患者个体获卵数制定了群体分型策略(即波塞冬标准),用以指导POR的个体化管理以及对于POR更加细致的分层,本研究主要涉及第2组和第3组人群,具体如下。第2组人群:年龄≥35岁,AFC≥5个,AMH≥1.2μg·L-1,前次IVF中获卵 数1~9个:第3组人群:年龄<35岁，AFC<5个AMH<1.2μg·L-1。

        1.2.2 IVF-ET适用范围按照中华人民共和国卫生主管部门2003年发布的《关于修订人类辅助生殖技术与人类精子库相关技术规范、基本标准和伦理原则的通知》(卫科教发[2003]176号)的有关规定:①各种因素导致女方配子运送障碍;②排卵障碍:③中度或重度子宫内膜异位症:④男方精液检査异常,如少精、羽精、畸精等:⑤免疫因素引起的不孕、不育或原因不明的不孕。

1.3中医辨证标准 

         纳人的中医证候为肾阴虚肝郁血瘀证,其辨证标准主要依据2012年中华中医药学会制定的《中医妇科常见病诊疗指南》和2016年第10版《中医妇科学》制订。主证:①月经量少:➁腰膝酸软;③情绪抑郁或烦躁易怒;经色黯。次证:①头晕耳鸣或耳聋:②口咽干燥;③失眠或健忘;④性欲减退;⑤五心烦热或潮热盜汘;⑥脱发或齿松;⑦胸胁、乳房胀痛;⑧善太息;少腹胀痛:⑩不思饮食:;四下腹刺痛。舌脉:舌质红或紫暗或有瘀斑、点,少苔或无苔,脉弦细数或弦滑或沉弦或涩。注:以上主证②~④项必备,伴或不伴①,次证~⑥､⑦~⑪每项必备1项,参照舌脉即可诊断。

1.4纳人标准

        ①既往IVF-ET失败史≥1次,拟再次接受IVF-ET;②符合波塞冬人群分类标准的第2组和第3组人群;③具备IVF-ET适应证,排除禁忌证;④患者无囊胚或冷冻胚胎:⑤所有患者的促排卵方案均选取拮抗剂方案;⑥中医辨证符合肾阴虚肝郁血瘀证标准者;⑦知晓并自愿地签署知情同意书。满足以上7项者方能纳人。

1.5排除标准

        ①不满足纳入标准者;②男方精液异常者;③属于过敏体质或对试验用药过敏者④有严重的基础疾病,如心血管、肝、肾和血液疾病或精神疾病者:⑤患有急性传染病或身体有器质性疾病者;⑥被诊断患有生殖器官畸形、生殖系统肿瘤或炎症者;⑦患有《母婴保健法》中规定的遗传性疾病者:⑧具有吸毒等严重不良嗜好者;⑨接触导致畸形剂量的放射线、毒物或药品并处于活性阶段。

1.6脱落及剔除标准

       ①依从性差,纳人试验后，未遵从医嘱服药,或无随访数据者:②自行使用悖离试验方案的药物,对试验有效性和安全性判断产生重大影响者:③在试验过程中出现严重不良反应、并发症或特殊生理变化,导致无法继续进行研究者;④用药后转至其他生殖中心辅助妊娠者。

1.7治疗方案

        1.7.1对照组口服脱氢表雄酮(DHEA,美国健安喜,规格25mgx90粒/瓶,建议患者自行购买)3个月经周期(口服,每天1次,每次25mg)+IVF-ET拮抗剂方案促排、取卵。本研究IVF-ET拮抗剂方案由四川大学华西第二医院生殖中心参照《体外受精胚胎移植技术实施指南》拟订并实施。

        1.7.2观察组口服中药汤剂(滋肾助孕方安安胎方)+耳穴贴压+补肾活血方导法治疗3个月经周期+IVF-ET拮抗剂方案促排、取卵。

        ①口服中药汤剂。滋肾助孕方组成为熟地黄10g(产地河南,批号220401)、山药15g(产地河南批号220211)、山茱萸10g(产地河南,批号220616-11)、枸杞子10g(产地宁夏,批号220403)茯苓10g(产地云南,批号220102)、当归5g(产地甘肃,批号220601)、酒白芍15g(产地安徽,批号220601)、炙黄芪25g(产地甘肃,批号2205003)、甘草5g(产地新疆,批号220331)。安胎方组成为桑寄生10g(产地广西,批号2205003)续断10g(产地四川,批号220502)、生地黄10g(产地河南，批号220402)百合20g(产地湖南,批号220526)地骨皮10g(产地四川,批号220216-11)、山药15g(同前)、枸杞子10g(同前)、白芍10g(产地安徽,批号220118)、黄芩10g(产地山西,批号220101)。①煎药方法:用冷水将药物浸泡15min,大火煮沸,再用小火熬煮15min,滤出药液,约200m,以同样的方法再煎煮2次,共滤出药液600m,将所有药液均匀混合,饭后30min,加热服用,1剂/2d,每天3次,每次100mL:②服药时间:月经周期第1天开始服用滋肾助孕方,持续服用21d,药后查血清人绒毛膜促性腺激素+孕激素:若自然受孕,则改服安胎方至妊娠后70d;若未受孕,则下一月经周期继续服用,连续服用3个月经周期。

        ②耳穴贴压。穴位:取穴选择肝、肾、神门、内分泌、耳迷根、额、颞、枕等穴位。方法:使用乙醇棉签擦拭消毒耳穴皮肤,将王不留行籽胶带(上海泰成科技发展有限公司,批号210207)贴在耳穴上,可保留5d,每天适当按压3次,使耳郭产生温热胀痛感,在月经周期的第1天开始贴压耳穴,每周更换1次,3次为1个疗程。

        ③补肾活血方导法。由菟丝子15g(产地内蒙古,批号2205002)、枸杞子10g(同前)、覆盆子10g(产地浙江,批号220109)、续断20g(同前)、山药20g(同前)、丹参10g(产地山东,批号220302)、丝瓜络15g(产地河北,批号2205002)、山楂15g(产地河北,批号220602)组成。补肾活血方的制剂由成都中医药大学附属医院中药房提供,经药剂科李涓主任药师鉴定符合2020年《中华人民共和国药典》版规定,药剂科根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(2021年版)》将上述中药饮片经水煎、滤过、浓缩、精制、纯化,制成免煎制剂(专利号ZL201410390113.7)。方法:排空大小便，侧卧位将臀部垫高,充分暴露肛门,常规消毒,将吸痰管以医用石蜡油润滑,插人肛门内8~10cm后固定,用50m空针抽取药液,药液温度以39~41℃为宜,连接吸痰管,缓慢而均匀地将药液推人直肠内,灌肠后尽可能使药液在肠道内保留1h以上,月经干净后直肠给药,1次/d,连用12d停。

        注:①若患者自然受孕,停用补肾活血方导法不再进人后续IVF-ET周期,动态监测血清人绒毛膜促性腺激素、雌激素、孕激素水平及B超结果,给予中药安胎方+耳穴贴压+西医常规黄体支持:若未受孕,则进人后续的IVF-ET周期。

1.8观察指标

        ①卵巢功能评估相关指标:基础生殖激素水平(包括bFSH、bFSH/bLH、bE2),AMH,AFC,获卵数,正常受精数及优胚数(I级、Ⅱ级胚胎数);②中医证候评分改善情况:疗效指数(n)=(治疗前评分-治疗后评分)/治疗前评分x100%。痊愈:n≥95%,症状消失或基本消失:显效:70≤n≤95%,症状明显减轻;有效:30%≤n<70%,症状有所减轻:无效:n<30%,症状无减轻或加重。总有效率=有效病例总数(痊愈+显效+有效)/病例总数x100%。③自然受孕情况、妊娠结局和自然受孕率(自然受孕率=自然受孕例数/本组总例数x100%)。

1.9统计学方法

        所有数据分析均采用IBM SPSS 26.0软件。计量资料组间比较:符合正态分布采用独立样本T检验分析,采用±s进行统计描述;不符合正态分布,采用非参数检验分析,采用中位数(M)和四分位数间距Q(Q=P75-P25)进行统计描述;计量资料组内比较:符合正态分布采用配对样本T检验分析;不符合正态分布,采用威尔科克森秩和检验分析;计数资料:采用卡方检验，Pearson Chi-Square检验(当T≥5时)或Fisher's Exact检验(当T<1或1≤T<5超过25%时)。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

        在中医药干预过程中,观察组自然受孕3人,不再进人后续的IVF-ET周期。所以,除去中医证候比较例数不变(观察组61人,对照组62人),其他疗效指标比较例数改为观察组58人,对照组62人。

2.1两组患者治疗前后基础生殖激素、AFC比较

        与本组治疗前比较，治疗后对照组患者bFSH/bLH值明显升高(Z=-1.990,P<0.05),而bFSH、bE2,AFC差异无统计学意义(Z=-1.79、-1.19、-1.11),观察组治疗后bFSH、bFSH/bLH、bE2,、AFC明显改善(Z=-2.39、-4.25、-3.04、-3.34,P<0.05,P<0.01)。与对照组治疗后比较,观察组bFSH、bFSH/bLH、bE2,AFC改善优于对照组(Z=-2.15、-2.79、-2.19、-2.37.P<0.05,P<0.01)。见表2。

2.2两组患者治疗前后IVF-ET获卵数、正常受精数、优胚数比较

        与本组治疗前比较,治疗后对照组获卵数、正常受精数、优胚数差异无统计学意义(Z=-0.04、-0.37、-0.07),观察组获卵数、正常受精数、优胚数均显著改善(Z=-4.01、-5.07、-5.12,P<0.01)。与对照组治疗后比较,观察组正常受精数、优胚数改善情况优于对照组(Z=-3.25、-4.06，P<0.01),两组获卵数差异无统计学意义(Z=-1.66)。见表3。

2.3两组患者中医证候比较

2.3.1两组患者治疗前后中医证候评分比较 与本组治疗前相比,对照组治疗后中医主证、次证、证候总评分均较治疗前升高(Z--3.12、-5.06、-4.50.P<0.01),观察组治疗后中医主证、次证、证候总评分改善显著(Z=-6.85、T=28.48、37.08，P<0.01)。与对照组治疗后比较,观察组中医主证、次证、证候总评分改善优于对照组(Z=-8.90、-8.94、-9.16，P<0.01)。见表4。

        2.3.2中医证候疗效比较 治疗后,观察组患者中医主证、次证、总证候疗效的总有效率均为100%(61/61),对照组患者中医主证、次证、总证候疗效的有效率均为12.9%(8/62),观察组总有效率高于对照组(c²=95.003、95.489、114.929,P<0.01)。见表5。

2.4两组患者自然受孕情况及妊娠结局比较

        本研究共纳人受试者128例,最终完成123例。观察组61例,3例自然受孕，其中2例为临床妊娠，1例为早期流产;对照组62例,无自然受孕者。本研究中部分患者的卵巢功能过差，以至于在观察组中有3人放弃自孕,在对照组中有5人放弃自孕;并且由于新型冠状病毒疫情影响,大部分患者因接种新冠疫苗严格避孕,观察组避孕患者有48人,仅10人未避孕,未避孕患者中仅自然受孕3人,自然受孕率为30.0%:对照组避孕患者有52人,仅5人未避孕对照组无自然受孕者。两组患者的自然受孕情况及妊娠结局组间比较差异无统计学意义。见表6和表7。

2.5不良反应发生情况研究过程中所有受试者均未发现不良反应。

3讨论

        DOR患者卵母细胞数量和质量的下降,会导致POR的发生,影响女性的生育力,增加流产和胎儿畸形的风险,从而降低ART的成功率,因此即便选择了ART助孕,生育效果依然不佳是生殖医学领域面临的一项重大问题。目前西医改善IVF-ET低预后患者卵巢功能的方法包括雌孕激素替代疗法雄激素、生长激素、自体富血小板血浆、人脐带间充质干细胞、维生素D、辅酶Q10、叶酸等,但存在一定的局限性。中医药领域采用口服中药、针灸穴位埋线、经皮穴位电刺激、内外治法综合治疗等手段有效提高了IVF-ET低预后患者的临床妊娠率，改善了妊娠结局。

        根据多年的临床经验和大量的前期研究，曾倩教授认为肾阴虚肝郁血瘀是拟再次接受IVF-ET拮抗剂方案低预后患者发病机制的关键。在IVF-ET控制性超促排卵过程中,垂体功能下降大量卵泡被募集,多个卵泡在短期内发育、成熟,将耗损大量肾精,使肾中精气严重亏虚。不孕症患者的生育要求非常强烈，而婚后长时间不孕、多次IVF-ET失败,生育压力大,造成精神紧张,肝失条达,疏泄失职,血海不充,最终导致胞宫失养,无法摄精成孕;金刃手术,如IVF-ET穿刺取卵或胚胎移植等,会损伤血脉,导致瘀血内停,瘀阻胞宫,容物困难,影响胚胎植人和生长发育,导致IVF-ET失败。

        针对IVF-ET失败后拟再次接受IVF-ET拮抗剂方案的低预后患者肾阴虚肝郁血瘀的病机关键,治疗应按照孕前和孕后两阶段进行，自然受孕前口服滋肾助孕方,以“滋肾活血化瘀,疏肝怡情助孕”为法;自然受孕后口服安胎方,以“滋阴固冲安胎”为要。滋肾助孕方由左归饮加减化裁而成,左归饮用纯甘壮水之品滋阴填精,但恐滋腻碍脾,故加人黄芪、当归,取其益气健脾、养血活血之效,“脾者土也,治中央,常以四时长四藏”,若脾气健运,水谷得化,气血充沛,运行通畅,则灌溉四旁,脏腑得养,生生不息。肝为刚强之脏,主疏泄,其体属阴,又主藏血,肝血易虚,其用属阳,肝阳易亢,故用熟地黄、山茱萸、白芍,与当归配伍,寓行于补,补而不滞,行而不损,使血脉充盈,肝气柔和,补益肝体,助长肝用使肝气条达,疏泄有度,郁结自消,全方共奏滋肾活血化瘀,疏肝怡情助孕之效。安胎方由保阴煎和寿胎丸加减而成,保阴煎填精益肾、凉血固冲,寿胎丸固摄冲任、贯通阴阳,全方共奏滋阴固冲安胎之效。

        前期研究发现在IVF-ET实施过程中,需应用大量激素,这使得女性的下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO)功能失调。以口服中药配合耳穴贴压疗法,可以有效调节此类患者的HPO功能,影响内啡肽和肾上腺皮质激素的分泌,维持体内激素水平的稳定使机体处于“阴平阳秘”的状态,卵子和胚胎质量得到改善,胚胎植入和临床妊娠比率得到提高，早期流产率随之降低。

        以往的实验研究发现,补肾活血方导法能够改善实验大鼠的卵巢功能,促进卵泡发育成熟,改善卵泡质量,促进子宫血管生成,改善组织血液察滞状态,减少子宫内膜炎症反应的发生,提高子宫内膜的容受性,促进胚胎植人。

        本研究中,对于IVF-ET失败后拟再次接受IVF-ET拮抗剂方案的肾阴虚肝郁血证低预后患者，通过多途径的中医药干预，可以降低bFSH、bFSH/bLH值、改善bE2水平,增加AFC、获卵数、正常受精数和优胚数,改善卵巢功能、月经状况和中医证候,提高生活质量,甚至使部分患者在再次进周前自然受孕,改善妊娠结局。总之,曾倩教授从肾阴虚肝郁血瘀的病因病机出发,针对拟再次接受IVF-ET拮抗剂方案的低预后患者进行多途径的中医药干预,在自然受孕前采用滋肾助孕方,同时配合补肾活血方导法和耳穴贴压调经助孕，自然受孕后采用安胎方配合耳穴贴压促进种子安胎,将中医内外治法结合应用于ART中,为中医药改善低预后拟再次IVF-ET患者卵巢功能、增加获卵数和优胚数、甚至使患者自然受孕提供了新的思路和方法。

        综上所述,低预后拟再次IVF-ET拮抗剂方案肾阴虚肝郁血瘀证患者接受中医药多途径干预,临床疗效确切,且安全性较高,值得推广并应用。但由于受到“新型冠状病毒”疫情影响,大多数不孕患者选择推迟妊娠计划,导致样本量不足;人组患者多因接种新冠疫苗选择严格避孕,加之本研究中部分患者因卵巢功能过差放弃自孕,因此本研究中观察组仅自然受孕3人,而对照组无自然受孕者。在后续研究中,需要进一步扩大样本量,提高低预后患者的自然受孕意愿,增加研究数据的说服力。