辅助生殖技术中，女性经过促排卵治疗，在卵泡尺寸达到一定直径成为成熟卵泡，在 B 超引导下用取卵针经阴道穿刺获取卵泡液，经过技术人员在卵泡液中寻找到卵冠丘复合体，培养受精等过程最终获得可移植胚胎。为提高获卵率，减少卵子在卵泡中滞留，双腔取卵针应运而生，可将液体反复注入卵泡进行冲洗，目的是最大程度获得卵子。已有文献报道经过卵泡冲洗可以提高获卵率，但是不同的患者在穿刺取卵中由于冲洗卵泡时间不等及卵泡冲洗难易程度不等，以至于卵子暴露在体外时间不同，由于环境的改变产生应激反应，从而造成不同程度的损伤。本文针对不同的患者有无卵泡冲洗和平均每个卵泡获取时间进行分组，从而探讨冲洗卵泡时间对助孕结局的影响。
1 材料与方法
1.1 对象选择及分组
2015 年－2016 年十堰市人民医院生殖医学中心行体外受精( in vitro fertilization，IVF) 助孕治疗的夫妇 499 对，年龄 25 ～ 38 岁，不孕年限 2 ～ 8 年。不孕原因包括输卵管性不孕 365 例，排卵障碍 101 例，子宫内膜异位症 18 例，免疫性不孕 2 例，原因不明13 例。排除因特殊原因取消移植的患者。按照是否进行卵泡冲洗分为冲洗组和未冲洗组，冲洗组获卵总数 1 355 枚，平均获卵时间为 2 min，按照单个卵泡冲洗时间( 患者取卵时间/获卵个数) 分为≤2min 组和＞2 min 组进行比较。
1.2 促排卵方法
所有患者均采用垂体降调节方案，患者于前次月经周期黄体期开始用达必佳针剂( 德国辉凌公司生产) 0．1 mg / d 垂体降调节，果那芬( FSH，瑞士雪兰诺公司 生 产) 或者果那芬联合绝经期促性腺素( HMG，珠海丽珠公司生产) 超促排卵，当 B 超监测直径达 18 ～ 20 mm 卵泡超过 3 个时，停用 FSH 和HMG，于当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺素( hCG，珠海丽珠公司生产) 5 000 ～ 10 000 IU，36 h 后经阴道 B超引导下穿刺取卵。
1.3 取卵及卵泡冲洗方法
取卵及卵泡冲洗方法参照本中心方法，患者取卵术前常规消毒局麻镇痛后，把阴道超声( 日本A lokaSSD－900 型超声诊断仪 ) 放入阴道探头及穿刺架，并了解子宫、卵巢的位置以确定进针位置。取卵针连接 15 mL 试管和负压吸引器，启动吸引器调试负压为 1．8 Kpa，将针刺入卵泡并抽吸，把卵泡液吸入试管内，用双腔取卵针( 美国 COOK 公司的 K－OPSD－1735－A－L 型) ，在卵巢内吸卵腔与冲洗腔可同时进行冲卵与吸卵。抽吸的卵泡液递进胚胎实验室由技术人员在体式显微镜下寻找卵冠丘复合体，若确认为卵子则无需再用取卵针抽吸冲洗卵泡。
1.4 受精与胚胎培养
受精后 16 ～ 18 h 观察原核情况，若出现两原核判断为正常受精。受精后胚胎在体外培养 24 ～ 48h，于取卵后的第 3 天根据 Ziebe S 等移植胚胎进行胚胎形态学评分，Ⅰ～ Ⅱ为优质胚胎，Ⅰ～ Ⅲ级胚胎均为可用胚胎，Ⅲ以上进行囊胚培养，移植 D5 囊胚，采用 B 超引导下宫腔内移植。妊娠的标准是胚胎移植后第 14 天血清 hCG 阳性为生化妊娠，临床妊娠为第 4 周 B 超检查有胎心搏动。优质胚胎率( 优胚率) = 优胚数/胚胎总数×100%，可用胚胎率 =可用胚胎数/胚胎总数×100%，囊胚形成率 = 囊胚形成数/培养囊胚数×100%。
1.5 激素检测
内分泌检测: 控制性超促排卵周期中 hCG 注射日晨抽取静脉血，应用 DXI800 全自动电化学发光免疫分析系统( 美国贝克曼库尔特公司) 进行内分泌( 血清激素 FSH、E2、P、LH) 的测定。相应试剂盒购自武汉德高科技有限责任公司，操作按试剂盒说明书要求进行，控制试剂批内及批间差异 10%以内。
1.6 统计学方法
应用 SPSS 13．0 软件进行数据录入和处理，计量资料以( x±s) 表示，采用 t 检验，计数资料以率表示，采用 χ2检验，P＜0．05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2．1 一般情况和 hCG 日血清性激素水平比较
两组患者的平均年龄、不孕年限、不孕原因、hCG 日血清 FSH、LH、E2、P 水平均没有差异性( P＞0.05) ，见表 1。
2.2 卵泡冲洗对妊娠结局的影响
卵泡冲洗组和未冲洗组共收集了 499 例长方案IVF 周期，其中冲洗组 154 例，共获卵 1 355 枚，未冲洗组 345 例，共获卵 3 381 枚。卵泡冲洗组和未冲洗组平均获卵数、获卵率、可用胚胎率、优质胚胎率、囊胚形成率、妊娠率无统计学差异( P＞0．05) ，冲洗组的卵子成熟率和正常受精率显著低于对照组( P＜0. 05) ，见表 2。
2.3 卵泡冲洗时间对妊娠结局的影响
卵泡冲洗时间≤2 min 组 89 例，共获卵 812 枚，＞2 min 组 65 例，共获卵 572 枚，两组患者的平均年龄、不孕年限比较无统计学差异( P＞ 0.05) ，hCG 日平均 E2、LH、P 水平、平均获卵数、成熟卵率和正常受精率、异常受精率均无统计学差异( P＞0.05) 。＞2min 组 hCG 日 FSH 水平、优质胚胎率、囊胚形成率、妊娠率显著低于≤2 min 组( P＜0.05) ，见表 3。
3 讨论
超声引导下经阴道后穹窿穿刺抽吸取卵已经成为辅助生殖中获得卵子的最佳途径。到目前为止取卵针的改进使取卵效率不断得到提高，双腔取卵针的出现，很大程度上弥补了单腔取卵针的不足，可以对卵泡壁进行冲洗，其中一个腔用来抽吸卵子，一个腔用来抽吸卵泡液，这样能够克服卵子潜在滞留在卵泡中的问题，以期待获得更多的卵子。国内研究报道卵泡冲洗能获得更多卵子，但并不能提高有效卵子数和有效胚胎数Haydardedeoglu B 等和 Kara M 等研究也表明卵泡冲洗并不提高获卵率，Levens ED 等研究表明卵泡冲洗对卵子数量的回收没有多大意义。本研究取卵过程中冲洗卵泡组和未冲洗组均采用双腔取卵针，结果显示卵泡冲洗组的获卵率略高，但并无差异性，这与文献报道基本一致，而冲洗组的卵成熟率略低于未冲洗组，分析原因可能由于卵泡冲洗时可能会把潜在滞留的卵子冲洗出来，而这些卵子成熟度欠缺，卵丘较小，致密，与卵泡壁连接紧密，不易从卵泡壁上剥离下来，以至于取卵针无法使这些卵丘剥离卵泡壁。研究中冲卵组受精率低于未冲卵组，原因在于卵泡冲洗出来的未成熟的卵子并不能正常受精，必然会引起正常受精率的降低。
对于受精后结局，研究表明，卵泡冲洗不增加获卵率，也不增加床妊娠率，这与本研究一致，但需要大样本证实。另有研究报道卵泡冲洗不能增加卵子回收数量，但可能导致胚胎植入率和妊娠率下降。这可能与卵泡冲洗时间有关，因为卵子经体内转移到体外，环境发生较大改变，在体外暴露时间越长，可能对卵母越不利。研究表明反复多次的冲洗卵泡并不增加卵母细胞回收数目，但可能增加卵母细胞形态异常的发生率，原因可能是反复冲洗延长了从体内转移到体外的时间和机械损伤，导致受精后不良的结局。
本研究对于卵泡冲洗时间进行了分组，在卵泡冲洗组里进行分组以 2 min 为节点，结果发现平均每个卵泡超过 2 min 时对胚胎质量和妊娠率有一定影响，这可能存在冲洗卵泡机会越多时间越长，一方面反复吹吸的作用可能使卵子发生机械性损伤，观察中发现有的卵丘颗粒细胞部分缺失与卵失去连接，可能是由于机械力的作用。另一方面文献已证实，卵子对温度、pH 及渗透压等外界环境非常敏感，轻微的变化即可引起不可逆改变，而卵泡过度冲洗使体外暴露时间过长，温度、酸碱度、渗透压可能发生变化，进一步增加对卵子化学损伤，影响后期胚胎发育潜能。本研究中＞2 min 组的患者成熟卵率并没有增加，未成熟率略有增加，原因也可能与卵泡的冲洗过程中不同的卵泡卵子成熟及颗粒细胞分散状态不一致，一些未成熟的卵子由于过度冲洗也从卵泡壁上冲洗下来。另外本研究中卵泡冲洗时间≤2 min 组的 hCG 日血清 FSH水平高于 2 min 组，原因可能是 FSH 浓度的升高使颗粒细胞发生脂肪化变性，卵泡液侵入到卵丘细胞之间，导致卵丘细胞之间失去粘连而彼此分散开来，最终使卵母细胞连同放射冠从卵泡壁上游离出来，悬浮于卵泡液中，这样有利于卵母细胞在卵泡壁破裂时随卵泡液一起流出，从而使这类患者更容易获得卵子。
我们的研究表明，卵泡冲洗在经阴道穿刺取卵术中可以提高卵子回收率，但是并不提高成熟卵的回收，也不会影响最终妊娠结局，但当平均单个卵泡冲洗时间延长超过 2 min 可能会影响胚胎质量。另外需要排除不均一性的因素，如: 患者卵巢功能，取卵针型号，冲洗培养基量不同，手术者的取卵熟练程度等。因此在取卵操作过程中把握每一个环节，控制在最短的时间内获得卵子，一方面需要提高取卵手术者的技能水平，另一方面促排方案的合理应用，使颗粒细胞疏松化，卵子成熟度达到同步化，才能提高取卵效率，获得理想的结局。
