研究问题：三维（3D）培养系统是否比二维方法提高小鼠胚胎干细胞（mESC）雄性生殖系分化的效率？
摘要答：我们基于直接球化的三维培养系统在促进mESC向减数分裂后雄性生殖细胞的新配子发生方面优于标准的二维平板。
众所周知：在干细胞研究中，二维单层细胞培养是很常见的。然而，该方法不复制生理三维空间关系，并且可能提供体内环境的不准确复制。三维球形结构使我们能够模拟生精小管，即体内精子发生的部位。通过使用球体作为支架复制细胞培养系统，我们可以在受控环境下研究精子发生。直接球化是分子烹饪学中常用的一种技术，它提供了一个机会来制造模拟体内事件的球体，这些事件在实验室中具体化。
研究设计、大小、持续时间：mESCs最初在6孔板上培养，并包被成纤维细胞，然后插入海藻酸钠微球中。为了诱导分化，将直径为3～6mm的微球直接插入分化培养基（DM）中，同时将6孔培养皿中的对照mESC与之分层。从两种培养体系中获得的细胞通过不同生殖细胞阶段的生物标记物进行检测。
对象/材料、环境、方法：在平板或球体上对80%汇合处的二维mESC进行分化，进行三维培养。两个系统接受相同的时间暴露于含激活素A、bFGF和KSR的EpiLC培养基3天和含BMP4、LIF、SCF和EGF的PGCLC培养基7天。在第3天和第10天从每种方法中提取分化细胞，以评估生殖系分化标记物、DAZL、VASA和BOULE。
主要结果及chance的作用：在EpiLC培养基中培养第2天，通过球壁可见细胞聚集，而在二维平板上未观察到这种现象。在常规方法中，细胞表达7%DAZL（精原细胞期）和1%VASA（精子细胞前期），而在直接球形化中，细胞表达20%DAZL（P<0.001）和15%VASA阳性（P<0.0001）。为了进一步比较不同方法在种系分化后期的效果，将剩余的种球在PGCLC培养基中培养7d。第10天，再次评估分离细胞的VASA和DAZL。在常规方法中，23%的细胞表达VASA阳性，29%的细胞表达DAZL，而直接球化法VASA阳性率为43%（P<0.005），DAZL阳性率为45%（P<0.005）。VASA和DAZL中表达的增加表明生殖系分化的细胞数量增加。此外，BOULE被评估是否存在减数分裂细胞，如精母细胞。常规方法阳性率<1%，而直接球化法阳性率为10%（P<0.005）。直接球形化结果表明，与传统方法相比，分化几乎加倍，在相同的时间内产生更多的减数分裂后细胞。
局限性，谨慎的理由：尽管在直接球形化中有较高的分化率，这些细胞仍然需要测试它们的受精潜能。实现受精、囊胚和活幼崽的能力将为这种新配子发生方法提供最终的证据和可靠性。
研究结果的更广泛意义：通过直接球形化分化胚胎干细胞为研究细胞间关系提供了另一种选择。这为通过复制生精小管的微环境来更详细地研究精子发生提供了机会。一旦新配子的胚胎发育能力被证实，这将开启人类生殖的新篇章。
试验注册号：不适用
