NAT10介导的N4乙酰胞苷对小鼠卵母细胞体外成熟的调控（⬅点击左侧文字观看视频）
研究问题：NAT10介导的RNA中的N4乙酰胞苷（ac4C）参与调节卵母细胞体外成熟（IVM）吗？
摘要答：NAT10介导的ac4C修饰是卵母细胞体外成熟过程中的一个重要调控因子，通过调节与翻译、线粒体功能和蛋白质失稳相关的基因来实现。
众所周知：与体细胞不同，卵母细胞成熟过程中转录和翻译是不耦合的，基因表达主要受转录后调控，包括mRNA降解、翻译和翻译后修饰，这些都是复杂的，尚未得到充分的研究。RNA-ac4C是一种新发现的mRNA修饰和转录后调控的关键决定因子，已被证明能促进mRNA的稳定和翻译，而NAT10是唯一已知的RNA乙酰转移酶。因此，NAT10介导的ac4C可能是卵母细胞成熟的表观遗传调节因子。
研究设计、大小、持续时间：收集小鼠不同发育阶段的卵母细胞，检测卵母细胞成熟过程中ac4C和NAT10水平的变化。在IVM前敲除GV期卵母细胞中的NAT10，以证实NAT10介导的ac4C在减数分裂过程中的调控作用，并进一步探讨其细胞机制。每个实验至少重复三次，数据分析采用卡方检验、单因素方差分析或非配对样本t检验。
对象/材料、地点、方法：采用免疫组化方法检测ac4C和NAT10的表达。RNA干扰电穿孔法在GV期卵母细胞中敲除NAT10。以ac4C和NAT10为靶点，采用qPCR和免疫组化方法证实基因敲除的有效性，并比较各组卵母细胞体外成熟率。采用高通量测序和RNA免疫沉淀的方法来揭示调控基因。通过RNA下拉和质谱鉴定与ac4C位点特异结合的蛋白质。
主要结果和chance的作用：我们首先从GEO检索到公开的数据，发现具有潜在ac4C位点的转录物在IVM过程中富集了下调的基因（P<0.001）。ac4C的偏态分布暗示了可能的调节作用。免疫组化显示，从未成熟到成熟卵母细胞，ac4C和NAT10的表达呈显著下降趋势。NAT10基因敲除后，ac4C修饰减少，减数分裂进程明显延缓。具体而言，NAT10基因敲除后的第一体挤出率（34.6%）显著低于未转染的对照卵母细胞（74.6%）和转染对照siRNA的卵母细胞（72.6%）（p<0.001），而生发泡破裂率不受影响（p=0.6531）。高通量测序和RNA免疫沉淀显示，被调控的基因在已知与卵母细胞成熟相关的生物过程中富集，包括翻译、线粒体翻译延伸和终止以及蛋白质失稳。此外，我们还通过RNA下拉和质谱鉴定了一系列与ac4C探针特异性结合的蛋白，通过这些蛋白，ac4C修饰可能发挥其转录后调控功能。
局限性，谨慎的理由：这项研究是在体外进行的。NAT10介导的ac4C在体内的作用还有待阐明。此外，受目前技术的限制，卵母细胞中的ac4C修饰无法检测到。我们在体细胞系中对调控基因和ac4C结合蛋白进行了探索。
研究结果的广泛意义：转录后调节在卵母细胞成熟中至关重要。本研究利用小鼠卵母细胞体外培养系统，确定NAT10介导的ac4C是IVM的重要调节因子。这为IVM的表观遗传学机制提供了新的认识，有助于临床IVM系统的完善。
试验注册号：不适用
