Kumi Sakurai：
博士后，人类遗传学系，加州大学洛杉矶分校，美国。
研究方向：抗逆转录病毒疗法产品和生物测定的研究和开发。
ART 中未被满足的需求：
一种更为先进的质量控制生物测定法观察生物分子在活细胞或者组织中的活性
可视化方式展现基因表达
检测表观遗传缺陷
避免基于形态学的胚胎分级的易变性
减少假阳性结果
迄今为止，人类辅助生殖技术产品质量检测方式大多使用单细胞小鼠胚胎试验（MEA）开展临床前研发。然而，这可能存在问题，因为这种生物测定方式不够灵敏且易变，并且缺乏标准化，只是主观地分析胚胎形态，而不是对其发育进行功能性分析。为了满足辅助生殖技术的需求，我们开发了一种更为先进的质量控制生物测定法，这种方法通过观察活细胞或组织中生物分子的活性，以可视化方式展现基因表达，检测表观遗传缺陷，避免基于形态学的胚胎分级的易变性，并减少假阳性结果。
2016 年，我们在《生殖生物学和内分泌学》杂志上发表了一篇论文，介绍了一项定性的功能生物测定方法，称为遗传学小鼠胚胎测定，简称 MEGA。在这项研究中，我们借助绿色荧光蛋白（GFP）的表达展示对 MEA 的改善，这种 GFP 的表达由 Oct4 基因（GFP调控元件）驱动。为提高测定灵敏度，检测胚胎生长环境中的次优物质，我们借助 Oct4 的功能及其调节作用，通过观察基因表达强度来确定周围环境对胚胎培养的影响。这里展示了佩尔多所做的一项研究。
这是 Oct4 相互作用组的示意模型。示意性模型表明 Oc4 相关蛋白作为染色质重塑复合物的一部分，或作为转录因子和辅助因子，在基础转录机制中具有直接作用。Oc4 相关蛋白也在表观遗传学、组蛋白修饰以及 DNA 复制、重组和修复中发挥作用。它还与调节酶（如 DNA 甲基转移酶）相互作用，并与定位信号相互作用。我们利用Oct4基因在小鼠着床阶段的关键作用，培育了表达绿色荧光蛋白标记Oct4基因的转基因小鼠，获取了转基因小鼠的单细胞胚胎，以建立一种先进的小鼠胚胎测定方法。
MEGA 和下一代 MEGA 测定（MEGA-NX）间比较
48 小时荧光评估法
MEGA-NX：定量
48 小时以细胞数分级
Oct4 绿色荧光蛋白在细胞核分布
MEGA：定性
以早期荧光强度（EFIs）分级
Oct4 调控元件编码的绿色荧光蛋白
在整个细胞中表达
1、利用 Oct4 启动子
2、一样的程序
3、48 小时分级
4、需要荧光显微镜
以下是在 MEGA 和下一代 MEGA 测定（我们称之为 MEGA-NX）中发现的一些特征。在体外培养 48 小时后，MEGA 胚胎发育到 8细胞阶段（球形），Oct-4 调控元件编码的绿色荧光蛋白在整个细胞中表达。早期荧光强度（EFIs）分为 0-3 级。这张图中 EFI 为 2-3 级。相反，MEGA-NX 胚胎中 Oct4 绿色荧光蛋白分布在细胞核，在体外培养开始 36 至 48 小时后变得清晰可见。MEGA 和 MEGA-NX 系统都利用了 Oct4 基因表达，以相同的方式进行，能够在 48 小时对其进行分级，且需要荧光显微镜。两者之间最大的不同在于，MEGA 是定性测定，MEGA-NX 是定量测定。MEGA-NX 的优点是该系统可将基因表达可视化，并能够跟踪活细胞中 Oct4 基因的定位。
为了确定 MEGA-NX 胚胎检测周围不良环境的效果，我们将MEGA-NX 胚胎暴露于次优油覆盖层，然后将其生长率与 MEGA胚胎进行比较。实验组的油中分别掺有 5%、7.5% 和 10% 的有害物质，覆盖在 20 微升液滴之上。48 小时后，对胚胎进行评级，其中 MEGA-NX 使用细胞计数法计算 8 细胞及以上胚胎的百分比，MEGA 使用早期荧光强度（EFI）2-3 级胚胎的百分比。结果非常令人兴奋，因为 MEGA 检测发现了杂质为 10% 的次优条件，而MEGA-NX 检测发现了所有的次优条件，且与对照组相比具有统计学意义。
接着，我们将 MEGA-NX 胚胎冷冻保存，看看将其复温并培养 96 小时后，是否可以得到与新鲜的单细胞 MEGA-NX 胚胎一致的结果。在这项研究中，我们比较了体外培养 48 小时和 96 小时的MEGA-NX 胚胎和 MEA 胚胎，以检测确定两种测定方式的兼容性。我们发现新鲜和冷冻保存的 MEGA-NX 单细胞胚胎产生的结果相似，但没有统计学意义，这对我们来说是个好消息。虽然冷冻保存的 MEGA-NX 检测到了所有三个次优条件，并且具有统计学意义，但 MEA 检测并不能做到这样，并且每次获取的结果之间存在差异。
我们在第 96 小时观察得到类似的结果，这表明第 48 小时的MEGA-NX 结果可以预测第 96 小时的评级。重要的是，与 MEA胚胎相比，MEGA-NX 胚胎更为敏感，如此处所示，能够检测低至掺有 5% 杂质的次优条件。
接着，我们用过期 16 个月或 3 年的 ART 培养基进一步测试了MEGA-NX 胚胎的敏感性。虽然 MEGA-NX 和 MEA 对照组的胚胎百分比都超出了标准线，但 MEGA-NX 能够识别出两种过期的培养基，而 MEA 两种培养基都超出了标准线。综上所述，我们证明了 MEGA-NX 是一种先进的小鼠胚胎检测方法，可以降低基于形态学分级的易变性并减少假阳性结果。有一点要注意的是，正如你所看到的，在过期三年的培养基中培养的 MEGA-NX 胚胎的基因表达（或 GFP 显示）较低，这可能意味着过期培养基在基因水平上有一些不利影响。
Oct4 相互作用组的示意模型：
定位、调节酶、表观遗传学 / 组蛋白修饰、复制 / 重组 / 修复、染色质重塑、转录因子和辅助因子、基础转录机制。
正如我前面提到的，Oct4在小鼠胚胎中具有关键功能和调节作用。使用Oct4-GFP作为生物标志物具有多种优势，能够在活细胞中可视化。
●与MEA相比，MEGA-NX是一种更为先进的定量生物测定方法
●MEGA-NX具有可作为胚胎发育和表观遗传学参数的特征
- 观察了活细胞或活组织中生物分子的活性
- 在体外培养48小时后，观察到了细胞核定位并检测到了Oct4的表达
- 降低了基于形态学胚胎分级的易变性
- 与MEA相比，减少了假阳性结果
我们的研究表明，与 MEA 相比，MEGA-NX 是一种更为先进的定量生物测定方法。我们证明了 MEGA-NX 具有可作为胚胎发育和表观遗传学参数的特征。我们观察了活细胞或活组织中生物分子的活性。在体外培养 48 小时后，我们观察到了细胞核定位并检测到了 Oct4 的表达。与 MEA 相比，MEGA-NX 降低了基于形态学胚胎分级的易变性，从而减少了假阳性结果。感谢大家的聆听。
