摘要
植入前基因检测（PGT）领域发展迅速，而最佳实践建议对于诊断检测的规范和标准化至关重要。之前在2005年和2011年发表的关于PGD最佳实践的ESHRE指南被认为已过时，因此有必要撰写新的论文，总结PGT良好实践建议。
本文提供了有关胚胎活检技术方面的建议，除了概述技术方面以及目前可用的特定技术在不同阶段（极体、卵裂期与囊胚活检）的优势与劣势外，还涵盖了对活检程序、冷冻保存以及实验室问题和培训的建议。此外，本文还简要介绍了一些取样方法。本文是有关PGT良好实践建议的四篇论文之一。其它论文涵盖了PGT组织、用于单基因/单基因缺陷（PGT-M）的PGT的不同技术方面，以及用于染色体结构重排/非整倍性的PGT（PGT-SR/PGT-A）的不同技术方面的建议。
综合起来，这些论文应协助专注于PGT的每个人开发最佳的实验室和临床实践潜力。†ESHRE页面的内容未经外部同行评审。本文已由ESHRE执行委员会批准发表。
本文对患者意味着什么？
本文介绍了植入前基因检测（或PGT）的良好实践建议。在2011年已经发表了类似的文章，但是这些文章需要更新为IVF和遗传学实验室中使用的新技术。
这些建议应帮助实验室人员和遗传学家根据最佳实验室和临床实践潜力来执行PGT。本文提供了关于胚胎活检技术方面的建议，即从卵细胞或胚胎中取样。然后可以在遗传学实验室检测该样品。
这些技术建议与患者并不直接相关，但应确保PGT患者获得最佳护理。
免责声明
此良好实践建议（GPR）文件代表了ESHRE的观点，这些观点是ESHRE相关负责人之间达成共识的结果，并基于准备时可获得的科学证据。
ESHRE GPR应该用于信息和教育目的。它们既不应被解释为制定护理标准，也不应被视为囊括了所有合适的护理方法，也不应当排除合理地旨在获得相同结果的其他护理方法。它们并不能取代基于每个个体表现进行临床诊断的需要，也不能取代基于地点和设施类型的变动。
此外，ESHRE GPRs并不构成或暗示对ESHRE列举的任何技术的认可或赞成。
引言
在对不孕症治疗中使用的术语进行修订之后（Zegers-Hochschild等，2017），以前的植入前基因诊断（PGD）和植入前基因筛查（PGS）术语已被植入前基因检测（PGT）取代。PGT被定义为一类检测，该检测的实施是为了分析卵母细胞（极体）或胚胎（卵裂期或囊胚期）的DNA以进行HLA分型或诊断遗传异常。这包括用于非整倍性的PGT（PGT-A），用于单基因/单基因缺陷的PGT（PGT-M）和用于染色体结构重排的PGT（PGT-SR）（Zegers-Hochschild等，2017）。在ESHRE PGT学会的数据集中，高遗传风险的染色体数目变异的PGT包含在PGT-SR中。
PGT始于1990年代，是一种实验方法，它最初采用基于聚合酶链式反应（PCR）的方法进行性别筛选和单基因疾病筛查。几年后引入了相间荧光原位杂交（FISH），并成为了对胚胎进行性别鉴定以及检测数目和结构染色体畸变的标准方法。在过去十年中，全基因组技术开始取代FISH和PCR的金标准方法，这一趋势对于PGT-A最为明显。PGT-A主要用于体外受精（IVF）患者，其最初目的是提高每次胚胎移植的怀孕率并降低流产率。最近增加了其他结果指标，例如增加选择性单胚移植和减少妊娠时间。被引用的PGT-A适应症包括高龄产妇（AMA）、复发性植入失败（RIF）和严重的男性因素（SMF）以及患有复发性流产（RM）的正常核型夫妇。对于所有IVF患者和/或合适的患者选择而言，该方法的价值仍在讨论中，但这不在本文的讨论范围之内（Harper等，2018）。
本系列论文的目的是提出在所有类型的PGT服务中都应遵循的最佳实践方案，包括PGT-A、PGT-M和PGT-SR。
为了使PGT达到与常规基因检测相同高的质量水平，一些协会已经设计了最佳实践指南。PGD国际协会起草了指南（植入前遗传诊断国际协会（PGDIS），2004；植入前遗传诊断国际协会，2008），而美国生殖医学协会则综述了PGT在美国辅助生殖技术学会实践委员会和美国生殖医学学会实践委员会的实践（2008），并发表了几篇评论性文章（关于囊胚培养、胚胎移植和PGT-A）。ESHRE PGT学会的第一批指南发表于2005年，因为该学会的任务之一是实现整体标准化并提高质量标准（Thornhill等，2005）。ESHRE PGT学会继与细胞遗传学欧洲质量评估（Cytogenetics European Quality Assessment, CEQA）和英国国家外部质量评估服务（UK National External Quality Assessment Service, UKNEQAS）合作之后，现在又一起与基因组学质量评估（Genomics Quality Assessment, GenQA）组织合作启动了外部质量评估（EQA）计划以提供独立的评估实验室，并帮助他们改善技术和报告。对原始指南的回顾提出了关于PGT不同方面的四组建议：一组关于PGT的组织，三组与所用方法有关：胚胎活检、基于扩增的检测和基于FISH的检测（Harton等，2011a，Harton等，2011b，Harton等，2011c，Harton等，20lld）。考虑到PGT服务提供的快速变化，现在正在更新和扩展这四个指南。在这些更新的指南中，执行诊断的实验室被称为PGT中心，执行IVF的中心被称为IVF中心。
PGT的一般方面，包括患者选择、咨询、怀孕以及儿童随访和转运PGT，会在有关PGT组织的论文中介绍。关于胚胎活检和装管的技术建议会在关于胚胎活检的论文中介绍。有关基因检测的建议会在关于检测数目和结构染色体畸变以及检测单基因疾病的论文中介绍。不同论文的内容与图1中的IVF/PGT临床程序一致。
ESHRE PGT学会认识到，由于地方或国家法规和特定实验室操作的差异，PGT的实施方式仍将存在差异（从最初的收治到体外受精治疗、基因检测到妊娠、分娩和儿童随访）。这并不排除根据经验和现有证据提出的关于最佳实践的一系列共识性建议。这些建议并非旨在作为唯一批准的实践标准，也不具有法律约束力。个别患者的个性化需求可能会需要对这些建议做一些变通，因此，必须根据每患者的个性化需求，基于专业判断来应用建议。但是，建议和意见可用于制定法律和法规，从业人员应确保其遵守本国的法定要求或临床实践指南。为了使本文简洁明了，已尽可能避免重复，并包括许多交叉引用。因此，建议在寻求有关PGT问题的指南时，不要独立地参考这些论文中的单篇，而应始终把这些论文当作一个系列来参考。
材料和方法
本文是根据针对ESHRE良好实践建议的已发表论文而编写的（Vermeulen等，2019）。有一个工作组由在所述技术上具有实操经验的人员组成，旨在代表不同的环境背景和国籍。工作组成员评估了以前的指南（Harton等，2011d），并起草了本文的主要内容。由于本文目的是提供技术指南和支持，正式文献检索被认为并不重要，因此，除参考其它指南文件外，未添加任何参考文献。所有小组成员都根据自己的专业知识写了一部分，随后与整个小组深入讨论，直至达成共识。共有11次线上会议被组织进行讨论。本文的终稿与该系列其他文件的一致性已被仔细确认。然后将终稿提交给参与方进行评审；本文于6月10日至7月10日在ESHRE网站上发表，并邀请ESHRE成员发表评论。工作组查验了所有评论，在一次线上会议上进行了讨论，并将有价值的评论整合进了本文的最终版。评审报告已被发布在ESHRE网站上。
图1 IVF/PGT过程概述，以及所有方面的讨论与四篇建议性论文中的对应关系。IVF：体外受精，PGT：植入前基因检测。
为了便于使用本文中的建议，在术语表（补充表SI）中解释了粗体和斜体的术语，并列出了缩写（补充表SII）。
结果/建议
活检和样品采集简介
本文为最常用的活检方法和用于基因检测的活检样品的采集提供了详细的技术建议。
植入前胚胎的活检过程包括两个主要步骤：在透明带（Zona pelucida，ZP）中制作一个切口，并移除极体（PBs）或胚胎细胞。
ZP打孔可以通过机械方式、化学方式或使用激光进行。
ZP打孔
机械性ZP打孔（也称为部分透明带剥离术）是最早用于打孔ZP的一种方法，如今仍在临床上应用，尽管应用较少。该方法包括使用锋尖锐的微量移液器在ZP中创建狭缝。
化学透明带钻孔涉及使用酸性溶液（泰洛德酸溶液）来局部溶解ZP。该方法在卵裂期胚胎活检的早期阶段被广泛使用。但是，随后激光技术的实施以及对酸泰罗德（Tyrode）对于胚胎生存能力潜在毒性的担忧，导致大多数实验室放弃了化学ZP钻孔技术。
激光是目前最流行的在PB、卵裂期和囊胚活检时的ZP切口方法。该方法包括使用被引导的非接触激光束，该激光束可以被调节以准确和快速的方式产生所期望尺寸的ZP切口。使用时应遵循制造商的规范小心处理激光束和曝光的功率（脉冲长度/宽度），以免损坏PB或胚胎细胞。
当进行PB或卵裂期活检时，切口的大小不应太大，以免在胚胎发育过程中造成卵裂球丢失。
样品（PB或胚胎细胞）移除
根据要进行活检的胚胎阶段和形态，已经描述了几种移除细胞的方法。通过在活检微吸管内抽吸移除细胞是应用最广泛的方法，并且适用于活检的所有阶段（PB、卵裂期和囊胚活检）。或者可以部分吸出细胞，然后将这些细胞从胚胎中拉出。通过挤出或流动置换移除细胞也已经应用于卵裂期胚胎，但是这些技术的临床应用仍然相当有限。
对于囊胚活检，可以使用激光抽吸和切除，或者将抽吸与机械性分离滋养层细胞（TE）手段相结合（称为轻弹）。
活检时间
可以通过分别从未受精卵母细胞或受精卵中移除一个或两个PB，在卵裂期移除一个或两个卵裂球，或在囊胚期移除几个（5-10）TE细胞来进行活检（图2）。尽管卵裂期活检是十多年来应用最广泛的胚胎活检形式（Harton等，2011d），但其临床应用现已减少。
由于有些特定地区或国家的法律禁止进行胚胎活检，或者如果仅排查母亲的致病变异、结构重排或非整倍性时，PB活检可作为胚胎活检的替代方法。
囊胚活检或TE活检是目前最广泛使用的技术手段（De Rycke等，2017）。它提供更多的细胞，并且处于胚胎阶段，更适合进行遗传分析，并且对可能的损伤敏感性更低。
样品采集
活检后，经过清洗的细胞要么被固定在载玻片上进行FISH分析，或收集在小的反应管中进行基于扩增的检测，这个过程被称为“装管”（“tubing”）。在过去十年中，随着全基因组技术开始取代FISH方法，并且这些技术要求第一步是全基因组扩增（WGA），装管已成为收集活检样品的最广泛应用的方法。本指南论文中已制定了有关装管的一般建议。
胚胎二次活检
仅在基因诊断失败、不完整或结论性不明确的情况下才应考虑对胚胎进行再次活检，因为对进一步胚胎发育的影响仍然有待研究。二次活检政策应符合当地法规。
与活检有关的实验室问题
在进行活检之前，应使用经证明在IVF实验室具有兼容性和有效性的消毒剂对工作表面、设备和材料进行清洁和消毒。
在与PGT有关的程序中，应穿戴防护服，包括完整的手术衣（干净、未经消毒且要定期更换）、发套/帽子、口罩（遮盖鼻子和嘴巴），最好是有鞋套或穿专用鞋。手套应始终佩戴并经常更换。手套应无粉且贴合性好（如丁腈，而不是乙烯基）。
受精与培养
• 对于PGT，为最大程度地降低来自残留卵丘细胞的母体污染和ZP上附着的多余精子的父方污染，胞浆内精子注射法（ICSI）更可取。为避免在活检标本中残留母体污染，至关重要的是在ICSI之前仔细清除卵丘细胞（剥离）和清洗卵母细胞，如果要在受精检查后进行IVF，则应清洗受精卵。
• 在进行活检之前，均应采用常规的IVF培养条件。应使用最适当的培养条件、策略和培养基。如果有条件，可以采用带有“封闭式”培养系统的延时成像系统，以防止胚胎处于次优条件下，且更容易确定活检的最佳时间。
• 活检后，应在培养或冷冻保存之前彻底清洗卵母细胞和胚胎以除去活检基质。
• 为单独培养胚胎，建议在单独的培养皿中使用多孔培养皿或微滴，以防止处理过程中由于意外移动而导致胚胎混合。
进行活检的准备工作
在对人卵母细胞或胚胎进行任何活检程序之前，提出了以下准备工作建议：
• 确保由合格的从业人员按照书面程序进行活检。
•最小化活检过程的持续时间。
• 在执行临床病例之前制定活检标准，并对所有临床病例遵守这些标准。应在必要时对标准进行常规更新。
• 确保按照书面程序对所有显微操作设备进行了正确的安装、校准和维护。活检必须在预热后进行。
• 确保有适当的试剂和显微操作工具可用，无菌且在有效期内。
• 确保有备好的活检皿、平放好并至少清楚地标记了患者的姓名（根据每个实验室的政策，仅女方或男女夫妻双方），以及卵母细胞/胚胎编号。活检皿中应包含清洗滴剂和一滴足够大小的活检基质，以在操作过程中在油下保持pH、渗透压、重量克分子渗透压浓度和温度。
标记与在场见证
关于PGT组织的论文概述了在整个IVF-PGT程序中进行标记与在场见证的一般建议（ESHRE PGT协会指导委员会等，2020）。对于活检/装管操作，建议在以下阶段要有人在场见证：（i）活检后立即确认卵母细胞/胚胎与样本名字匹配；（ii）在铺展或装管时，分别确认样本标识与相关载玻片或收集管上的标签相符；（iii）对于进一步的卵母细胞/胚胎培养、在将卵母细胞/胚胎放入培养皿中并进行标记时；（iv）在冷冻保存的情况下，在获取遗传分析结果之前，在活检后立即进行的将卵母细胞/胚胎进行放置和标记进入冷冻保存装置；（v）对于进一步进行的胚胎培养，将胚胎放入培养皿并贴上标签；（vi）诊断结果公布后确保结果与正确的样本和/或胚胎鉴定的准确性和相关性；（vii）在解冻/保温过程中以及选择要移植的胚胎时。
与活检标记和在场见证有关的其他特定问题：
• 活检的卵母细胞和胚胎必须使用清晰的识别系统进行单独培养或冷冻保存，以确保活检样品（PB、卵裂球或TE细胞）追踪和明确的诊断后识别。
• 当打印的标签或条形码不可行时，应在冷冻支架上写上卵母细胞/胚胎编号，最好是数字和字母。
• 为了确保基于卵母细胞/胚胎的可追溯性，即使有电子目击系统，也必须有见证人以便核对。
质量控制
有关质量管理和风险评估的一般建议在有关PGT组织的论文中进行了介绍（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。
• 由于活检是侵入性的，可能会损坏细胞和DNA。因此，有关活检样品完整性（细胞裂解、变性、降解等）的信息应予以记录并与遗传实验室共享。
活检实验室基础设施、设备和材料
基础设施
胚胎学实验室设计应包括活检专用区域。建议在工作量较大的IVF中心建立单独的活检实验室来提供适当的功能。无论是专用区域还是房间，活检实验室的设计均应考虑到“IVF实验室规范操作的修订指南”第3节叫做“实验室安全性”的章节中建议的所有安全和环境标准（空气质量、正压、实验室通道等），以确保规范的实验室操作并最大程度地减少对生物材料的破坏作用（ESHRE指南小组关于IVF实验室的规范操作等，2016）。
建议在靠近活检专用区域或房间的位置进行装管（见“样本收集”部分）。
设备
活检设备设置包括一个带加热台的倒置显微镜、三维微操纵器和微型注射器（空气或油），放置在防振垫上，相当于对ICSI程序的设置。另外，在工作区域附近应该有一个立体镜（用于在活检皿中转移卵母细胞/胚胎以及用于装管）和培养箱，它们应被放在邻近工作区域的位置。建议所有设备均应具有CE标识，并应考虑当地法规。辅助孵化和囊胚活检可能需要特殊设备，如激光。激光通常包含在倒置显微镜的×25或×40物镜中，并由软件和照相机控制。可以使用鼠标或脚踏开关控制激光。
材料
在开始活检程序之前，应准备以下材料：
– 毛细管；
– IVF认证的餐具；
– IVF认证的矿物油；
– 缓冲介质（HEPES、MOPS或其他）；
– 微吸管，根据活检阶段的不同而不同。移液器可以与ICSI相同，也可以使用直径合适的移液器。根据活检阶段，活检移液器具有专用的直径（PB活检为10–15 μm，卵裂期活检为30–35 μm，囊胚活检为25–30 μm）。
活检培训
胚胎活检实验室应由在临床胚胎学方面具有公认专业知识的人员进行监督指导，最好还有医学遗传学的基本知识。
活检程序应由具有一般胚胎学和显微操作基本技能的经验丰富的从业人员操作，他们应事先接受过适当的培训并遵循标准操作步骤（standard operating procedures, SOPs）。经验丰富的从业者人数取决于程序数量。建议至少有一位备用从业人员。与SOPs和程序的偏差应被适当的记录并提供理由说明。
活检的培训应符合常规胚胎学认证所要求的标准，并应记录在案。每个活检阶段（PB、卵裂期、囊胚期）的培训应包括两个步骤：临床前培训和临床监督培训。
–对于临床前培训，建议至少使用50个卵母细胞或50个胚胎来进行活检过程的所有步骤（即打孔ZP与移除细胞）。材料的来源将取决于当地法规。符合步骤要求的受训人员可以继续进行临床培训。
– 临床监督培训中，如果从业者具有显微操作的丰富经验，则应至少包括20个卵母细胞或胚胎，而没有经验的从业者应包括40个卵母细胞或胚胎。为了评估临床培训，需要监测持续培养后或解冻/温育后的活检后损伤和存活率。此外，应评估活检样本的损伤/裂解以及扩增结果。所有参数均应与实验室标准和PGT学会的数据相当（De Rycke等，2017）。
– 活检应由临床胚胎学家监督，最好持有其本国的相关证书和/或临床胚胎学的ESHRE证书。
活检阶段和程序
PB活检
PB（极体）是女性减数分裂的副产物，它可以预测母亲对胚胎的贡献的基因型。多数情况下。极体1（PB1）与极体2（PB2）可以根据玻璃体周间隙内的大小、形状和位置区分开来。
活检的组织。PB活检可以同时或依次进行。
– 在同时进行活检时，在授精后6到9 h之间取出PB1和PB2。
– 在依次活检中，PB1在取卵后4小时内去除，PB2在受精评估后（授精后16至18 h）去除。也可以及早取出PB2（授精后6至9小时）。
冷冻/温育的卵母细胞可以像新鲜卵母细胞一样进行活检。
活检步骤。
• ZP切口应使用激光或机械方式进行，且孔的直径应适合活检移液器的直径。
• 在依次活检中，抽吸PB1后，卵母细胞受精并检查前核的存在和PB2的挤出，PB2是以与PB1相同的方式被去除。尽管可能需要第二个缝隙才能触及第二个PB，但应避免这么做，因为这可能会影响囊胚孵化。
• 在同时活检时，PBs需要被放置在同一个焦平面，并且在ZP上做单个切口以减少伤损。
• 根据PGT分析的方法，在将PB1和PB2分别转移到单独的试管中或固定之前，应该被清晰地区分和识别。在同时进行活检时，应报告对PB1和PB2的区分。
• 活检后的卵母细胞/受精卵会被冷冻保存或返回培养。
胚胎移植和冷冻保存。根据该中心的政策，转移胚胎可以在卵裂期或囊胚期。可以根据IVF实验室政策和患者的偏好对受精卵或多余胚胎进行冷冻保存。
胚胎二次活检。如果当地法规允许，可以考虑在卵裂期或囊胚期再次进行活检。
卵裂期活检
活检的组织。卵裂期活检是在授精后的第3天，在胚胎发育的六细胞阶段和紧致前阶段之间进行。确切的时间依据实验室程序的时间而有所不同。冷冻/温育胚胎可以在第3天进行活检，与新鲜胚胎类似。建议在第3天对处于六个或更多细胞阶段的且具有可接受分级（碎裂片< 25%）的胚胎进行活检，并要求根据实验室政策进行。考虑到较低的植入机会和可能的遗传诊断问题（误诊、诊断失败），可以对碎片在25％ - 50％之间的胚胎进行活检。或者，可以将这些胚胎培养到囊胚期进行活检。
活检程序。根据制造商的建议，在活检培养基中孵育后，活检可以直接在活检培养基中（不含Ca2+/Mg2+）或在HEPES缓冲液中进行。
ZP孵育/打孔/裂孔使用激光或机械方式进行。ZP缺口应达到活检移液器的直径。建议可视化细胞核以确保除去有核细胞，并避免对双核细胞进行FISH。如果卵裂球裂解，建议更换活检移液器。然后将活检的卵裂球固定或装管进行进一步的PGT分析。继续培养前，应在培养基中轻轻但彻底地清洗活检的胚胎。
建议仅对一个细胞进行活检。然而，为使基因检测的准确性达到可接受的水平，或是存在细胞裂解或无细胞核的情况时，可能需要对两个细胞进行活检。
胚胎移植和冷冻保存。活检后，根据标准IVF培养条件培养胚胎。可以在受精后第4天或囊胚期转移。建议在囊胚期冷冻保留多余的胚胎。
胚胎再次活检。根据胚胎的形态、发育和胚胎移植政策，可以在后续的阶段考虑再次活检。建议使用原来的ZP缺口位置。
囊胚活检
囊胚期的TE活检允许移除数个细胞用于基因检测，同时不侵入用于胎儿发育的内细胞团（inner cell mass, ICM）。
活检的组织。可以对新鲜的或先前低温保存的已经评估过囊胚形成的胚胎进行囊胚活检。一旦ICM清晰可见，在受精后第5-7天根据其发育进度进行囊胚活检。或者，可以将这些胚胎进一步培养直至扩张。确切的时间根据实验室程序的时间而有所不同。冷冻保存/温育的囊胚一旦达到再扩张，就可以进行活检，与新鲜胚囊胚类似。
活检程序。活检程序可能会因囊胚的形态和质量、扩张程度和ICM的位置而异。此外，操作员和实验室之间也存在一些差异。
活检在缓冲液介质中进行。
对于囊胚活检，强烈建议使用非接触式激光，首先在ZP上打孔，然后切除TE细胞。图3描述了几种对未完全孵化的囊胚进行活检的方法：
• 可以在授精后的第3-4天进行ZP打孔，并在授精后的第5-7天移除TE细胞。
• 可以在囊胚形成的当天早些时候进行ZP打孔，然后进行一段时间的培养以使TE细胞从ZP中突出并移除TE细胞。
• 在囊胚完全扩张的当天，同时进行ZP打孔和TE细胞的去除。
为了进行活检，囊胚ICM的定位应在7点至11点钟之间进行，以使其清晰可见并远离ZP缺口，并避免通过移液器吸取ICM。然后轻轻抽吸将TE细胞吸入活检移液器。激光脉冲要对准细胞之间的交界处，以切除从囊胚中吸出的细胞，或是为在通过轻弹活检移液器机械分离TE细胞时使细胞损伤达到最小化。建议尽可能少地发射激光。
如果囊胚已完全孵化，活检仍可进行，并建议联合激光脉冲和轻弹动作以切除TE细胞。
• 为进行基因检测，建议对5-10个TE细胞进行活检（根据发育阶段和组成囊胚的细胞数量而定）。去除10个以上TE细胞对胚胎发育的影响仍然是一个需要进一步研究的领域。
• 不含Ca2+/Mg2+的培养基不得用于囊胚活检。
• 为避免在活检期间发生交叉污染，建议为每个囊胚更换活检移液器。或者也可以彻底清洗活检移液器，但应在实验室中验证这么做可以满足避免交叉污染的需求。
• 另外，建议活检后，立即将囊胚转移到培养基中或冷冻保存。
胚胎移植和冷冻保存。如果可以在短时间内获得基因检测结果并且胚胎还没有进入高级阶段（在活检时完全孵化），则可以在新鲜周期中进行胚胎移植。如果只能在几天后获得结果，则必须将胚胎冷冻保存。玻璃化冷冻法是囊胚冷冻保存的既定技术。活检后应立即按照冷冻保存程序冷冻保存胚囊。
囊胚活检与冷冻保存之间的时间非常重要；建议在再扩张之前尽快将其冷冻保存，特别是在囊胚完全孵化的情况下。
胚胎再次活检。根据囊胚形态，可以考虑在冷冻保存之前或之后在囊胚期进行活检。再次活检之前，需要足够的时间使囊胚腔重新扩张。建议使用原来的ZP打孔位置。二次活检后，建议立即进行冷冻保存。
一般优势和局限性
表1总结了这三种活检方法的主要特征。
PB活检
如果根据当地法规，活检只能在配子融合之前进行时，PB活检将是PGT的唯一选择。PB是母体减数分裂的废物。活检只能在第1天进行或在第0天和第1天都进行。在任何情况下，两个PB都是成功/准确诊断所必需的，并且必须可靠地区分和识别。同时进行活检比依次活检花费的时间更少，但更为复杂，因为对PB1和PB2的辨别可能会出现问题，尤其是在PB有碎片的情况下。
有丝分裂错误以及来自父方的减数分裂错误和致病变异无法从PBs中检测到。但是，如果是母源性减数分裂非整倍性或母体病原体变异，这种活检策略足可用于检测。
PB活检需要较高的工作量，因为所有卵母细胞和/或受精卵都必须进行活检，而不论是否要使其进一步发育（这在此阶段是无法预测的）。而且，存在技术性并发症的中等风险，例如PB的碎片或变性。
活检后，可以在等待遗传结果的同时进行胚胎扩大培养，但这不是强制性的。如果要这么做，PB活检方法可与新鲜胚胎移植兼容。
卵裂期活检
卵裂期活检会导致对单个卵裂球进行收集（不鼓励移除两个细胞）。在这个发育阶段，卵裂球可能对胚胎的正常发育有贡献，因为它们对ICM或TE的贡献还没有被确定。
这种活检可以检测到父母双方的减数分裂错误，但是有丝分裂错误导致的染色体镶嵌无法由单个卵裂球估计。
由于分析的是单细胞，因此DNA的数量是有限的，不明诊断的发生率预计会低于10％。但可以在囊胚期再次进行活检，且此时的活检仍在允许新鲜胚胎移植（如果需要）的时间范围内。
卵裂期活检仅在第3天进行。卵裂期活检需要中等至较高的工作量，因为通常不会在受精后第3天之前捕获受精卵，且都须进行活检，无论是否使其进一步发育（这在此阶段是不可预知的）。活检后，可以在等待遗传结果的同时对胚胎进行胚胎扩大培养，并用于新鲜的胚胎移植或冷冻保存。
这种方法的特点是具有迄今为止最高的全球经验，并且其复杂性较低。
囊胚活检
TE活检需要在第5-7天从一部分囊胚中收集多细胞切片（5-10个细胞），囊胚可产生胎盘和胚外膜（胎儿来自ICM，并被完整保存）。
与替代性活检方案相比，囊胚活检具有多个优势，包括通过分析大量细胞获得更高的可靠性。
替代的囊胚活检方法（图3）涉及不同的学习曲线和技能水平，具体如下：（i）第3天和第4天基于孵化的策略更耗时，但更容易，除非孵化是从ICM开始；（ii）基于当天孵化的策略也比较耗时，因为它需要不断检查囊胚（理想情况是通过延时孵化器进行检查），但这也是最简单的方法；（iii）同时进行ZP打孔和TE细胞回收的策略是最省时的方法，但对于实验室人员来说这是一项较难掌握的技能。这三种程序之间的选择取决于实验室策略。
从第5天到第7天，在繁忙的IVF诊所应计划较多的时间间隙用于TE活检；然而，每位患者的活检胚胎较少，即只对达到这个发育阶段的胚胎活检。TE活检后，由于PGT所需的检测策略的周转时间问题，冷冻保存通常是强制性的。因此，实验室必须制定有效的冷冻保存方案。
减数分裂错误可由TE进行可靠地评估。在既定的技术、方法和生物学限制下，导致染色体镶嵌的有丝分裂错误有可能被检测到，这主要取决于用于进行PGT的技术手段、每个遗传实验室内定义的验证参数以及对镶嵌囊胚的活检组织回收不可避免的采样偏差。
由于对多个细胞片段进行了分析，因此DNA的含量较高，不明诊断率预计低于5％。此外，囊胚活检提供了一种有效的方法，可以在WGA之后对来自同一样品的不同病症（例如染色体异常和致病变异）进行多种分析。
样品收集
活检后，将细胞清洗固定在载玻片上进行FISH分析（称为“铺展/固定”），或收集在小的反应管中进行基于扩增的检测（称为“装管”）。将活检细胞有效转移至载玻片或反应管是成功实现PGT循环的关键步骤。铺展/固定或装管需要仔细、准确地处理样品，以防止外源DNA污染。
关于FISH样品的铺展和固定，已经描述过几种方法，这些方法现在仍然可用（Harton等，2011c）。由于全基因组技术已在很大程度上取代了FISH方法，因此本节的其余部分专门用于描述装管。
与装管有关的实验室问题
装管应在严格的预防措施下进行，以最大程度地减少污染并增加扩增的机会。
人员应穿着防护服，包括完整的手术衣（干净、未经消毒且要定期更换），头套/帽子，口罩（遮盖住鼻子和嘴巴），最好是有鞋套或专用鞋。手套应始终佩戴并经常更换。这些手套应该贴合性好（例如丁腈，而非乙烯基检测用手套）。
装管的材料和试剂应由PGT中心的工作人员或IVF中心的工作人员根据参考基因实验室的指示事先准备。
标记与核对。关于标记与核对的一般建议在有关PGT组织的论文中提出（ESHRE PGT联盟指导委员会等，2020）。
质量控制。关于PGT组织的论文中提出了有关质量管理和风险评估的一般建议（ESHRE PGT联盟指导委员会等，2020）。
实验室基础设施，设备和材料
基础设施。装管区域应处于无DNA环境中。装管区域所需的DNA去污措施大多与IVF的规范实验室操作不兼容。
因此，建议在活检区域附近的专用区域或房间内进行装管。
设备和材料。每次使用前，工作表面、设备等都应使用DNA去污溶液或10％的漂白剂清洁，尽管后者在胚胎学实验室中不建议被使用。不建议仅使用70％的乙醇溶液，因为它不能去除DNA污染。
为了最大程度地减少污染，应在专用的层流罩或专用清洁区域中进行材料和试剂的制备，以及活检细胞的装管，并在每次使用前用UV-C光照射来去除DNA污染。装管设备的设置还包括微量离心机和立体镜或倒置显微镜。
• 所有溶液或试剂应尽可能即买即用，并且应为“分子生物学”等级或同等级别。所有试剂（购买的和内部的）都应进行测试（效率和污染情况）及验证。使用的所有塑料制品，包括移液器枪头，均应具有不含DNA和DNase的认证。
• 根据实验室的质量标准，应记录生产批号以进行追溯。
• 尽可能将溶液或试剂分成小等分试样，并且对于临床病例，不得重复使用等分试样。
• 建议避免对试剂进行反复冻融使用。
• 材料和试剂可以用UV-C照射或高压灭菌（如果适用，例如管架）。或者，可以将内部制备的试剂和溶液高压灭菌，最好使用PGT专用高压灭菌锅或过滤除菌后进行UV-C照射。
装管材料和试剂应远离任何DNA源，最好存放在预扩增区域。
在开始进行装管操作之前，应准备以下材料：
– IVF认证的培养皿；
– IVF认证的矿物油；
– 转移用移液器。
装管培训
装管过程需要充足的训练，这与胚胎活检训练是分开的。与胚胎活检相似，装管的培训应由经验丰富的合格临床胚胎学家/活检医生和/或专业的遗传学家进行监督，该专家应有资质并被授权依据当地或国家法规进行临床诊断（另见活检培训）。进行装管培训应评估扩增结果并确保无外源DNA污染。
装管程序
• 在进行活检之前，应于培养皿中备好矿物油，油下有数滴清洗缓冲液。若不使用矿物油，应在装管操作前于培养皿中立即准备既定滴数的清洗缓冲液。
• 用的反应管必须事先备好且被清楚地编号。
• 活检后的细胞在转移到反应管之前，应该用灭菌移液器至少清洗两次。在清洗TE上的细胞时一定要格外小心，因为它们通常很黏。而在不同清洗步骤之间，应特别注意避免造成遗传物质的丢失。
• 建议对每个胚胎使用新的移液器以防止DNA交叉污染。
• 如果在清洗或转移过程中单个细胞或一部分细胞样品发生裂解，则移液器可能已被污染，必须丢弃。对于卵裂期活检，应尽可能对另一个卵裂球取样。
• 随活检细胞一起转移到反应管中的培养基量应最少化（<1 μl）。在储存或处理之前，可将反应管在微量离心机中离心。
• 无论是否经过显微镜观察，都可以将活检细胞转移到反应管中。
• 装管可以在PBS中或直接在裂解缓冲液中进行，取决于PGT中心的操作规程要求。碱性蛋白酶和蛋白酶K/十二烷基硫酸钠处理均可用于裂解细胞。
• 建议在每个细胞样品收集过程中，每种缓冲液（样品收集缓冲液或清洗介质，取决于PGT中心的规程）至少有一个阴性对照，以控制污染（即IVF实验室阴性对照）；例如，对一组特定胚胎两个不同时间点的收集应至少产生这种类别的两个阴性对照。由于与几个细胞相比，处理单个细胞时污染风险要高得多，因此最好增加阴性对照的数量。
装管后，可以将样品保存在室温下、冷藏或冷冻，具体取决于保存时间、实验室条件和遗传实验室的建议。
对于活检细胞的运输，可以依据IVF中心与PGT中心之间服务级别协议的后勤安排，选择室温、冷藏或冷冻进行。在运输过程中，反应管中包含活检材料的缓冲液可以用矿物油覆盖。如果使用干冰（固态二氧化碳）运输细胞，建议将反应管密封好并彻底包装好，最好放在带盖的管架中，并装在塑料密封袋中，以防止二氧化碳接触到样品。
活检后卵母细胞/胚胎的冷冻保存
在有些情况下进行PGT时，可以冻结卵母细胞/胚胎，具体取决于实验室策略和当地法规：
（i）活检之前（例如卵母细胞/胚胎的积累；先前非PGT周期的多余卵母细胞/胚胎）;
（ii）活检后（即测试平台通常需要冷冻保存，这是必不可少的步骤，以便让遗传室有时间分析样品）；
（iii）或在活检和诊断后（例如新鲜胚胎已经转移，但需要保存多余的经过检测的胚胎）。
在植入前发育的任何阶段，建议通过玻璃化冷冻保存，并且相同的方案适用于活检和非活检胚胎。活检胚胎必须在贴有适当标签的冷冻支架中单独玻璃化，并且必须有人在场监督。
在少数PGT病例中，可能需要多个玻璃化-温育周期。然而，这种方法对胚胎生存能力/植入和临床结果的影响仍需进一步研究。
建议每个中心根据其经验和效果制定其各自对PGT胚胎的冷冻保存/玻璃化的政策。
替代性活检方法
桑葚期活检作为一种可选的活检方法正在接受验证（图4）。
桑葚期活检
桑葚期胚胎的活检在第4天经人工破损（需要不含Ca2+/Mg2+的培养基）后进行，其特征是细胞间接触的丧失和球形细胞形状的重塑。它在技术上类似于卵裂期活检，但允许采集与囊胚活检相同数量的细胞。在广泛的临床应用之前，该技术需要更多的验证。
替代性采样方法
无细胞DNA分析（囊胚穿刺与用过的培养基）作为基因检测的替代性采样方法正在被验证（图4）。
囊胚穿刺
囊胚腔液包含无细胞基因组DNA，可使用微创方法收集。DNA经纯化和扩增后可以进行下游基因检测。迄今为止，该技术的效果和准确性不足，需要进一步完善才能在临床上应用。
用过的培养基
从胚胎培养基（以无创方式）获得的无细胞基因组DNA具有用于基因检测的潜在价值。该技术当前的局限性之一是无法将胚胎DNA与DNA污染的来源区分开。这种方法仍需要进一步优化。
