摘要
植入前基因检测（PGT）领域正在迅速发展，最佳实践建议对于诊断测试的规范和标准化至关重要。先前在2005年和2011年发布的ESHRE关于PGD最佳实践的指南被认为已过时，因此有必要撰写新论文，概述PGT良好实践的建议。本文提供了有关单基因/单基因缺陷（PGT-M）的PGT技术方面的建议，并涵盖了有关PGT-M基本方法和检测策略的建议。此外，针对特殊情况还提出了一些具体建议，包括De novo致病变异、近亲、HLA分型、排除检测以及由线粒体DNA致病变异引起的疾病。本文是有关PGT良好实践建议的四篇论文之一。其它论文涵盖了PGT中心的组织、胚胎活检和装管，以及PGT在染色体结构重排/非整倍性的技术方面。总之，这些论文应协助专注于PGT的每个人开发最佳的实验室和临床实践潜力。
ESHRE页面的内容未经外部同行评审。该稿件已由ESHRE执行委员会批准。
这对患者意味着什么？
本文介绍了植入前基因检测（或PGT）的良好实践建议。在2011年已经发表过类似的文章，但是这些文章需要更新到IVF和遗传学实验室中使用的新技术。
这些建议应帮助实验室人员和遗传学家根据可能的最佳实验室和临床实践进行PGT。本文为单基因疾病的遗传学检测提供了建议，这些疾病是由一种基因的变化（以及在基因中发生这种变化的位置已知）引起的疾病。遗传检测的目的是选择一个没有引起疾病的基因变化的胚胎，然后将其转移回母亲。
这些技术建议与患者并不直接相关，但应确保PGT患者获得最佳护理。
免责声明
此良好实践建议（GPR）文献代表了ESHRE的观点，这些观点是ESHRE涉众之间达成共识的结果，并基于准备时可获得的科学证据。
ESHRE GPR应该用于信息和教育目的。它们不应被解释为制定护理标准，也不应被认为包括所有适当的护理方法，且不排斥合理地旨在获得相同结果的其他护理方法。它们并不能代替对每个个体表现进行临床判断的需要，也不能替代基于地点和设施类型的变化。
此外，ESHRE GPR并不构成或暗示对ESHRE认可或赞成其中包含的任何技术。
引言
在对不孕症治疗中使用的术语进行修订之后（Zegers-Hochschild等，2017），先前的植入前基因诊断（PGD）和植入前基因筛查（PGS）术语已被植入前基因检测（PGT）术语取代。PGT被定义为分析卵母细胞（极体）或胚胎（卵裂期或囊胚）的DNA进行HLA分型或确定遗传异常的检测。这包括用于非整倍性的PGT（PGT-A），用于单基因/单基因缺陷的PGT（PGT-M）和用于染色体结构重排的PGT（PGT-SR）（Zegers-Hochschild等，2017）。ESHRE PGT联盟的数据收集中，PGT-SR包含用于高遗传风险的染色体数值异常的PGT。
PGT始于1990年代，当时作为一套基于聚合酶链式反应（PCR）的实验方法被用于性别筛选和单基因病检测。几年后引入了相间荧光原位杂交（FISH），并成为了对胚胎进行性别鉴定以及检测数目和结构染色体畸变的标准方法。在过去十年中，全基因组技术开始取代FISH和PCR的金标准方法，这一趋势对于PGT-A最为明显。PGT-A主要用于体外受精（IVF）患者，其最初目的是提高每次胚胎移植的怀孕率并降低流产率。最近增加了其它结果指标，例如增加选择性单胚移植和减少妊娠时间。被引用的PGT-A适应症包括高龄产妇（AMA），反复植入失败（RIF）、严重的男性因素（SMF）以及患有复发性流产（RM）的正常核型夫妇。对于所有IVF患者和/或适当的患者选择而言，该方法的价值仍在讨论中，但这不在本文的范围之内（Harper等，2018）。
本系列文章的目的是提出在所有类型的PGT服务中都应遵循的最佳实践方案，包括PGT-A以及PGT-M和PGT-SR。
为了使PGT达到与常规基因检测相同高的质量水平，一些协会已经设计了最佳实践指南。PGD国际协会起草了指南（2004、2008），而美国生殖医学协会则综述了美国的PGT实践（美国辅助生殖技术学会实践委员会和美国生殖医学学会实践委员会，2008）并出版了一些评论性文章（关于囊胚培养、胚胎移植和PGT-A）。ESHRE PGT学会的第一份指南于2005年发表，因为该学会的任务之一是实现整体标准化并提高质量标准（Thornhill等，2005）。ESHRE PGT学会与细胞遗传学欧洲质量评估（CEQA）和英国国家外部质量评估服务（UKNEQAS）合作，现在一起与基因组学质量评估（GenQA）组织启动了外部质量评估（EQA）计划，以提供独立的实验室评估，并帮助他们改进技术和报告。对原始指南的回顾提出了关于PGT不同方面的四组建议：一组关于PGT的组织，三组与所用方法有关：胚胎活检、基于扩增的检测和基于FISH的检测（Harton等，2011a，Harton等，2011b，Harton等，2011c，Harton等，2011d）。考虑到PGT提供服务的快速变化，现在正更新和扩展这四个指南。在这些更新的指南中，执行诊断的实验室将被称为PGT中心，执行IVF的中心将被称为IVF中心。
PGT的一般方面，包括患者选择、咨询、妊娠以及儿童随访和PGT运输，会在有关PGT组织的论文中介绍。关于胚胎活检和装管的技术建议将在关于胚胎活检的论文中介绍。有关基因检测的建议会在关于检测数目和结构染色体畸变以及检测单基因疾病的论文中介绍。不同论文的内容与图1中的IVF/PGT临床程序一致。
ESHRE PGT学会认识到，由于地方或国家法规和特定实验室操作的差异，PGT的实施方式仍将存在差异（从最初的收治到体外受精治疗、基因检测到妊娠、分娩和儿童随访）。这并不排除根据经验和现有证据提出的关于最佳实践的一系列共识性建议。这些建议并非旨在作为唯一批准的实践标准，也不具有法律约束力。个别患者的个性化需求可能会需要对这些建议做一些变通，因此，必须基于专业判断根据个体患者的需求应用建议。但建议和意见可用于制定法律和法规，从业人员应确保其遵守本国的法定要求或临床实践指南。为了使本文简洁明了，已尽可能避免重复，并包括许多交叉引用。因此，建议在寻求有关PGT问题的指南时，不要独立地参考这些论文中的单篇，而应始终把这些论文当作一个系列来参考。
材料和方法
本文是根据针对ESHRE良好实践建议的已发表论文而编写的（Vermeulen等，2019）。一个工作组由遗传学家组成，他们在所描述的技术上具有实操经验，旨在代表不同背景和国籍。此工作组成员评估了以前的指南（Harton等，2011b）并为本文起草了大纲。由于本文目的是提供技术指南和支持，正式文献检索被认为并不重要，因此，除参考其它指南文献外，未添加任何参考文献。所有小组成员都根据自己的专业知识写了一部分，随后与整个小组深入讨论，直到达成共识。共有11次线上会议被组织进行讨论。本文的终稿与该系列其他文件的一致性已被仔细确认。然后终稿提交给参与方进行评审；本文于2019年6月10日至7月11日被发表在ESHRE网站上，并邀请了ESHRE成员撰写评论。PGT指导委员会检查了所有评论，在一次在线会议上进行了讨论，并整合进了本文的最终版。评审报告已被发表在ESHRE网站上。
图1 IVF/PGT过程概述，以及所有方面的讨论与四篇建议性论文中的对应关系。IVF：体外受精，PGT：植入前基因检测。
为了更容易使用建议，在词汇表（补充表SI）中说明了特定术语，并列出了缩写（补充表SII）。
结果/建议
PGT-M简介
本文为PGT-M最常用的方法提供了详细的技术建议。
PGT-M指检测能引起单基因遗传病，具有常染色体显性、常染色体隐性或X连锁传播模式的核DNA致病变异以及线粒体DNA（mtDNA）致病变异。它还指排除检测和HLA分型，不论是否同时检测单基因疾病。
PGT-M的最大挑战之一是输入的DNA量少，需要灵敏的DNA扩增技术。对活检的单活检（极体（PB）或单卵裂球活检后）或很少的细胞进行活检[5–10个滋养外胚层（TE）细胞]，通过多重PCR或全基因组扩增（WGA）步骤进行靶向扩增反应，然后进行下游应用（靶向或全基因组），例如PCR、单核苷酸多态性（SNP）阵列或下一代测序（NGS）（图2）。每种方法都有其优点和局限性。这些方法大多数的原理是基于单倍型的（即确定一起遗传的单个染色体上遗传区段内的等位基因组）。因此，在临床前检查过程中，在具有已知遗传状态的夫妇和相关家庭成员的DNA样本中对位于目标基因附近的遗传标记进行基因分型。要选择信息丰富的、位于目标基因座两侧并允许区分亲本单倍型的遗传标记用于临床检测。具有家族致病变异的家庭成员中常见的单倍型被称为高风险单倍型（或突变体），而没有家族致病变异的单倍型被称为野生型或低风险单倍型。当同时评估致病变异和连锁遗传标记时，可直接进行临床检测，或当检测仅基于单倍型时，可间接进行临床检测。
低DNA量的局限性与DNA扩增失败（AF）、DNA污染或等位基因缺失（ADO）—此种情况下，杂合样本中的两个等位基因之一被扩增，而另一等位基因却未检出—现象增加的风险有关。与分析数个细胞相比，分析单个细胞通常更具挑战性。这些事件中的任何一种的发生都可能对诊断结果的可靠性产生严重影响，因此必须采取预防措施以最大程度地减少它们的发生，或者在检测设置及其临床实践过程中改善对它们的检测。
本部分提出的建议与所应用的检测方法无关。
培训和人员
• 基因检测程序应在专业的遗传学家的监督下进行，该专家应具有胜任能力并有权根据地方或国家法规执行临床诊断。
• 所有进行基因检测的人员均应在遗传实验室中接受适当培训，并应遵守书面的标准操作程序（SOP）。
• 应记录每种技术的培训。在处理临床样本之前，以下建议适用于每个受训者：
◦ 对于装管的培训在有关PGT的PB和胚胎活检的论文中进行了讨论（ESHRE PGT学会和SIG胚胎学活检工作组等，2020）。
◦ 对于靶向PCR，建议对30至50个单细胞或少量细胞样品进行多重PCR，进行两个或三个独立的检测回合并成功扩增。应包括阴性对照以监测每一轮的污染情况。
◦ 对于WGA，建议对30至50个单细胞或少数细胞样品进行WGA，并建议WGA产物在多个单独的检测回合中在下游应用中被成功处理。应包括阴性对照以监测每一轮的污染情况。
实验室基础设施，设备和材料
关于PGT组织的论文涵盖了基础设施、设备和材料的一般方面（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。
标签和双人核对
关于标签和双人核对的一般指导已包含在有关PGT组织的论文中（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。
单细胞或少量细胞方法
PGT-M可细分为检查前过程和临床周期（检查过程）。
检查前过程包括临床前检查和信息/分离分析并最终进行检测开发和验证。为了进行信息/分离分析，对夫妇和相关家族成员的DNA样品进行短串联重复标记（STR）或SNP标记基因分型，以鉴定信息性标记并确定标记等位基因（单体型）的组合是哪种与致病变异分离。如果在检查过程中确定了高风险单倍型，则可以采用一种间接检测方法。或者选择一种直接方法，将致病变异的检测与单倍型确认的遗传标记相结合。在某些情况下，例如存在De novo致病变异或无法获得相关家族DNA样品的情况下，无法在检查过程中确定高风险单倍型（另见De novo致病变异）。在这些情况下，可以根据在临床周期中活检胚胎细胞的结果进行确定。
以下部分描述了致病变异和遗传标记基因座，以及最常用的检测方法。
致病变异和遗传标记基因座
致病变异基因座可以是核或线粒体，并涉及血统遗传变异，这些变异经证明可引起疾病（以前称为突变）。致病变异本身是否被纳入临床检测取决于多种因素，包括致病变异的性质（家族性的或从头开始的）、相关家庭DNA样品的可获得性、变异类型和临床前检查结果。对于线粒体疾病，变异总是包含在其中的，因为该检测是基于确定胚胎中存在的遗传变异的百分比。
STR标记是短串联重复的DNA序列（最常见的是二核苷酸），在人类基因组中高度多态，并且非常丰富（每2000–10 000 bp一个STR）。有用的STR标记取自已发表的论文或选自公共数据库的生物信息学数据，通常涉及许多等位基因（高杂合度）。用荧光标记的引物靶向STR基因座，并在多重PCR反应中一同扩增。
提供完整信息的STR标记对于四个亲本等位基因的每一个都有不同的扩增子大小，从而可以区分所有可能的胚胎基因型，并检测污染、ADO、重组和拷贝数异常等问题。提供部分信息的（半信息或提供有限信息的）STR标记不能表征所有胚胎基因型的区别，并且在检测其他问题方面的能力较弱。非信息性STR标记无法区分受影响和未受影响的胚胎。在常染色体显性遗传疾病的一个例子中对此进行了说明（表1）。
根据其信息性对标记的排名考虑了低风险单倍型上独特等位基因的存在，从而证实了该单倍型的存在。在开发新检测时可以使用排名，但是现有程序中包含的任何（部分）信息性标记都可能会有所帮助，而与排名无关。
SNP多为双等位基因，与STR相比，每个标记的信息量较低。三个信息性SNP提供的信息量相当于一个信息性STR，但SNP更为丰富（每300-1000 bp一个SNP），更易于解释和进行高通量分析。
当可以明确区分高风险和低风险等位基因时，一对夫妇的SNP组合可以提供丰富信息。当野生型等位基因为唯一时，信息性SNP标记最有力，因为未受影响的胚胎随后被杂合的SNP区分，从而限制了ADO引起的误诊风险。此种情况在常染色体显性遗传疾病的一个例子中被说明（表II）。
首先分别评估每个标记的信息性结果；之后，评估所选标记用于临床检测的的整体有效性，以评价其用于评估与单基因疾病相关的胚胎状态以及其它参数，如ADO的发生、单体性、三体性与来自父母（主要是母源）的污染）的能力。
等位基因鉴别的基本方法
PCR引物对扩增了致病变异和标记基因座，其中一个引物被荧光标记，以便之后可以灵敏地检测扩增产物。设计这种方法是为了使得野生型和致病或高风险等位基因的区分成为扩增本身的一部分[例如，双重扩增阻滞突变系统（D-ARMS）]或等位基因区分是在扩增后步骤（例如微测序）中进行的。在某些情况下，在开始扩增后反应之前，可能需要进行DNA纯化步骤以除去扩增反应的引物和缓冲液（buffer）成分。
片段长度分析。
检测原理 这种方法基于荧光标记的DNA分子根据其分子量或大小的不同迁移模式。片段长度分析通常通过自动测序仪上的毛细管电泳进行。STR标记和插入/缺失致病变异基因座的等位基因区分是直接在PCR之后通过片段长度分析进行的。
检测的局限性 对于致病变异，在PCR之后通过片段长度分析进行的直接等位基因区分仅限于产生不同大小DNA片段的变体。尽管区分相差1 bp的片段在技术上是可行的，但可能仍需要另一种策略来进行更准确的区分。对于其它位点，例如SNP和单核苷酸变体，它们不生成不同大小的PCR产物，直接扩增方法是存在的（例如D-ARMS），但通常在扩增后进行PCR后反应以进行等位基因区分。直接检测复杂和/或更大的基因重排可能不可行，因为确切的断裂点通常是未知的，或者由于单细胞或数个细胞靶向的PCR片段通常保持在500 bp以下而无法扩增。
对于STR，尤其是带有二核苷酸重复序列的STR，伪带假象（stutter pattern，大小上少了一个重复单元）可能会使等位基因的区分复杂化，并使数据解释更加困难。
限制酶消化。
检测原理 DNA序列变异检测的一种常见形式是基于限制性内切酶识别特定DNA序列并切割非常接近或位于变异位点的链的能力。由于变异可以产生或破坏限制性位点，因此片段长度分析可揭示变异的存在与否。此方法是PCR后反应，可能需要事先进行DNA纯化步骤。限制酶消化后进行片段长度分析。建议始终检查完整的限制酶切消化。
检测的局限性 如果致病变异产生或破坏了限制性酶切位点，则可以使用这种方法。如果不是这样，可以调整引物设计以产生人工限制性位点。
最好在致病变异破坏而不是产生限制位点的情况下应用此方法。当致病变异破坏限制性位点时，正常等位基因将被消化，而突变等位基因将保持未消化。当致病变体产生限制性酶切位点时，消化失败或消化不完全可能导致误诊。
双扩增阻滞突变系统。
检测原理 双扩增阻滞突变系统（D-ARMS）允许对单核苷酸致病变异的野生型和致病或高风险等位基因进行扩增。该检测依赖于一组三个PCR引物：一个普通的荧光标记引物，以及两个位于目标位点的引物且最后的3’末端核苷酸与单核苷酸致病变异重叠，一个引物对正常等位基因具有特异性，而另一个引物对突变等位基因具有特异性。在一条引物的5'末端添加了一条尾巴，以便在单轮PCR和片段长度分析之后可区分野生型和致病型或高风险等位基因。对于ARMS引物，建议在每个特异性引物3'端上游的三个和五个核苷酸之引入一个额外的错配，以提高致病型或高风险与野生型等位基因之间的区分潜力。
检测的局限性 当致病变异是核苷酸延伸的一部分时，不建议采用D-ARMS，因为致病或高风险与野生型等位基因之间的扩增特异性差异可能不够大。
实时PCR用于致病变异检测和基因分型。
检测原理 实时PCR是一种封闭管系统，可实时监测扩增，不需要PCR后处理步骤。第一轮多重PCR在巢式实时PCR之前进行，以实现多重的同时扩增变异基因位点（或基因座）和信息性标记使变异位点（或多个基因座）。探针设计灵活，最常用的是杂交和水解探针。有许多适用于PGT-M基因分型的实时PCR平台和化学物质。
检测的局限性 这种方法需要专用的仪器，并且多重检测的可能性受到实时PCR平台的限制（检测器通道数量有限）。
微测序（Mini-sequencing）。
检测原理 微测序基于Sanger测序，但不对整个PCR产物进行测序。微测序反应需要纯化的PCR产物作为模板，以及一个特异的未标记微测序引物（正向和/或反向），该引物旨在退火至目标位点附近。微测序引物延伸有单个双脱氧核苷酸，与靶位点互补。每个双脱氧核苷酸都标记有不同的荧光染料，从而可以在自动测序仪上区分等位基因。该检测方法主要用于碱基取代的情况，但也可用于小的插入或缺失。
检测的局限性 当这种方法用于对小的插入或缺失情况进行检测时，无论致病变异是否存在，核苷酸可能是相同的，并且应调整微测序引物的设计。
单细胞或数个细胞靶向的扩增
胚胎活检后，将活检的细胞样品洗涤，转移至反应管中并裂解。然后将扩增反应组分直接添加到裂解的细胞中，而无需事先纯化DNA。样品通过多重PCR或WGA（全基因组扩增）进行靶向扩增（另见“单细胞或数个细胞的全基因组扩增”）。防止外部DNA污染以及精确而严格的样品处理是必要的。这需要专门的实验室环境和工作实践。
当对单个或几个细胞进行靶向扩增时，以下建议适用。
实验室基础设施、设备和材料。关于PGT组织的论文涵盖了基础设施、设备和材料的一般方面（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。特别针对靶向的基于扩增的PGT，提出了以下建议：
基础设施
• 遗传实验室和活检实验室之间应从物理上隔开。
• 扩增前区域（最好是带有专用层流罩的正压室）和扩增后区域（最好是负压室）之间应有物理隔离。建议将热循环仪放在专用的房间（扩增区域）中。如果无法做到这一点，可以将它们放在扩增后区域中。
• 当存在正压室和负压室时，最好将它们用锁定室封闭。
• 二级扩增反应可以在扩增后区域中一个简易腔室（例如PCR工作站）中进行，也可以在专用区域中一个有限的区域进行样品处理。
• 每个指定区域都应使用专用的设备（包括热循环仪）、消耗品和实验室外套，并且不得在这些区域之间交换。
• 应采取适当的单向工作流程，避免扩增产物回流到扩增前区域。
• 扩增前和扩增后房间/区域最好配备有UV-C灯以进行DNA净化。
设备。基于扩增的样品分析所需的设备包括：
- II类安全柜，最好装有UV-C灯，以防止在扩增前阶段污染样品；
- 简易腔室；
- 带加热盖的热循环仪；
- 微量离心机、涡旋仪和移液器；
- 用于扩增后片段分析的毛细管凝胶电泳设备。
材料。靶向扩增样品所需的特定材料包括：
- 裂解缓冲液，（预）扩增酶和所用每种扩增方法的特异引物/探针；
- 毛细管凝胶电泳材料。
样品装管。关于活检和将样品转移到反应管（称为装管）的一般建议见关于PGT的PB和胚胎活检的论文（ESHRE PGT学会和SIG-胚胎学活检工作组等，2020）。
工作实践控制。建议使用阳性和阴性（无DNA）对照。
• 作为阳性对照样品，建议从夫妇中稀释和/或未稀释的基因组DNA。也可以包括其他家庭成员的DNA样本。另外，可以使用单个或几个细胞样品。阳性对照细胞样品可以是淋巴细胞、颊细胞或培养细胞。如果检测包括致病变异检测，建议使用：
◦ 对于显性疾病：具有高风险和低风险基因型的DNA样本；
◦ 对于X连锁疾病：具有高风险、低风险、男性和女性基因型的DNA样本；
◦ 对于隐性疾病：具有杂合的致病变异载体、纯合的正常和（如果有的话）纯合或复合杂合基因型的DNA样品。
• 应包括阴性对照，以确保没有从样品采集过程或扩增反应中引入污染。
◦ 建议每份缓冲液至少有一个阴性对照（样品收集缓冲液或洗涤介质，取决于PGT中心的规程），以控制细胞样品收集每一步的污染（即IVF实验室阴性对照）；例如，在两个不同时间点采集的特定胚胎群应该至少产生两个这种类型的阴性对照。由于与检测几个细胞相比，检测单个细胞污染风险要高得多，因此阴性对照的数量最好要增加，最好每个活检胚胎都有一个阴性对照。
◦ 建议至少设定一个仅含扩增混合物的阴性对照，以控制扩增反应建立过程中的污染（即遗传实验室阴性对照）。
单个或几个细胞的WGA
胚胎活检后，将细胞样品洗涤并转移到反应管中。细胞裂解后，无需事先纯化DNA就可以添加WGA反应组分。WGA可从微少的DNA样品中提供足够的DNA模板以进行后续的DNA扩增，或与其它下游技术一起使用，例如多重标准PCR检测、基于阵列的比较基因组杂交（aCGH）、SNP阵列或高通量分析如NGS。此外，根据当地质量体系或法规，WGA产品应被保存多年（在-20°C下），以利于以后及时使用以确认结果/诊断或进行新的检测。
随着时间的推移，已经开发了几种WGA方法且可通过商业试剂盒获得。任何WGA技术都应在基因组覆盖率、序列的高保真度、拷贝数变异的可靠定量以及ADO和等位基因插入（ADI）的技术错误方面进行评估。应根据下游应用的功能选择WGA方法，并考虑其优缺点。目前，推荐将多重置换扩增（MDA）用于PGT-M（例如SNP单倍型），而置换简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）（出售商品名为Picoplex/Sureplex）是检测染色体拷贝数变异的重要方法。
将WGA应用于单个或几个细胞时，以下描述了有关实验室基础设施、设备与材料、装管与对照的建议。
实验室基础设施、设备和材料。通常，请遵循“单个或少量细胞靶向扩增”部分中所描述的建议。
针对基础设施、设备和材料，特别是针对WGA，提出了以下附加建议。
基础设施。由于WGA是第一轮（主要）扩增步骤，因此应在前扩增室/区域中进行。从WGA产物开始的反应被视为二次反应，应在单独的区域中进行。在进行下游应用之前，应确认扩增成功。
设备。其他设备包括：
– 凝胶电泳设备，检验扩增是否成功；
– 用于DNA定量的荧光计；DNA定量系统的使用（确定WGA之后扩增的DNA的数量）则是可选的；
– 特定设备，取决于下游应用。
材料。样品的WGA所需的特定材料包括：
– 用于每种WGA方法的专用试剂；
– WGA之后用于DNA定量的试剂；
– 具体试剂，取决于下游应用。
样品装管。关于PGT的PB和胚胎活检的论文提供了有关活检和装管的一般建议（ESHRE PGT学会和SIG-胚胎学活检工作组等，2020）。
工作实践控制。如单细胞或少细胞靶向扩增部分所述，应包括阳性和阴性对照以监测WGA反应。
仅在WGA反应水平包含有这些对照，而在下游反应中它们是可以忽略的。
检测前过程
检验前过程包括临床前检查、信息/分离分析、检测开发以及验证。
信息/分离分析。
• 建议从授权实验室获得原始分子遗传报告，包括对鉴定出的变体的描述以及合适的基因参考序列。建议尽可能确认致病变体。
• 建议进行临床前检查，以评估PGT M的可行性，鉴定信息丰富的遗传标记，建立父母单倍型（如果可能）并制定临床检测策略。
• 建议对STR标记和SNP标记进行信息性/分离分析。结果允许评估胚胎中的预期基因型。
• 有血统和连锁分析经验的遗传学家应确定为获得可靠和准确诊断，需要哪些家族DNA样品。
• 对于所有疾病，应从已知疾病状况的准父母和近亲（通过遗传报告证明）中收集样本，以确立高风险和低风险单倍型。
◦ 对于显性疾病，建议这些样品包含至少一名（理想情况下为两名）和/或一名未受影响个体的DNA作为参考。
◦ 对于隐性疾病，至少应包括受纯合性或复合杂合性的受影响个体，一名携带者和一名非携带者作为参考。
◦ 对于X连锁的疾病，必须将一名受影响个体用作参考和/或一名未受影响个体。还建议使用经过验证的载体。
• 如果没找到合适的家庭成员，则应在夫妇中进行信息分析，并在临床周期（或单个精子）中确立分离。
检测策略与检测开发
根据信息/分离分析结果确定检测策略。临床上已经应用了不同的扩增和等位基因鉴别策略。
PGT-M的三种主要检测策略是：
（i）在单细胞/少量细胞多重PCR中有或没有致病变异的信息性标记的靶向扩增（见“PGT-M的靶向扩增”和“PGT-M和PGT-A组合的靶向扩增”部分）。
（ii）在WGA之后，用含或不含致病变异的的信息性标记进行靶向扩增（见“WGA之后对PGT-M进行靶向扩增”部分）。
（iii）在WGA之后用遗传学方法，如SNP阵列或基于NGS的测序（见“WGA之后对PGT-M的一般检测”和“WGA之后对PGT-M与PGT-SR/PGT-A组合的一般检测”部分）。
与基于WGA的策略相比，第一个策略（即在单细胞/少量细胞多重PCR中靶标扩增信息标记），包括开发/验证新的检测，更加耗时费力，转诊和临床周期之间的周转时间显著增加。该方法的主要缺点是，必须对每个新的目的基因/基因座/变异重复进行在单细胞/少量细胞水平上的多重PCR的开发和验证。第二种策略（WGA之后进行靶向扩增）是朝着更通用方法迈出的一步，因为可以从临床前检查中省去单细胞水平上PCR反应的适用/验证。以基因型（致病性变异检测，SNP）或等位基因长度（STR）的形式，在两种情况下都可以获得基因座特异性信息。然而，由于其靶向性，这些检测大多不能提供基因组的全面观测。第三种方法，即全基因组通用方法的开发，解决了这个问题。SNP阵列以及基于测序的方法可以进行全基因组单体型分析和拷贝数分型。整个基因组的分析程度取决于平台和/或方法。基于SNP阵列的方法受到所选平台上固定探针数量的限制。基于测序的方法可以或多或少的更全面一点，取决于基因组覆盖率、SNP密度和测序深度。此外，基于测序的方法是高通量的并且可以实现自动化，从而减少了操作时间，并最大程度地减少了人为错误发生的可能性。基于WGA的策略大多与TE活检相结合，这通常留给新胚胎移植的时间不足。这一点可以通过冷冻保存和延迟胚胎移植周期来解决。
以下各节给出了有关检测开发的进一步建议。
PGT-M的靶向扩增。多年来，在单个/少量细胞水平上单独或与致病变异联合扩增遗传标记一直是PGT-M的“金标准”方法。在临床检测中采用遗传标记可提高准确性，因为它不仅可以进行间接致病变异分析，而且还可以检测ADO、污染和重组。
单细胞或少量细胞靶向扩增中关于基础设施、设备、材料、装管和工作实践控制的建议，在“单细胞或少量细胞靶向扩增”部分中进行了介绍。在临床前检查中，需要信息学/分离分析，以及在单个或几个细胞水平上进行基因座特异性检测的开发。基于信息学/分离分析的结果，选择接近目标基因座的合适STR标记，以单独或与致病变异组合方式进行多重PCR共扩增。
PCR反应条件的调适通常分几步进行。所选择的—最合适的—扩增子优选首先在基因组DNA样品上多重扩增。然后使用单细胞或少量细胞样品进行进一步的微调。为了进行检测开发，建议对每一次扩增反应，至少设置一个仅含扩增混合液的阴性对照。当处理单个或少量细胞时，也应添加仅带有样品收集缓冲液的阴性对照，以控制样品收集过程中的污染。然后，将优化的单细胞/少量细胞PCR方案与阳性和阴性对照一起在一系列单细胞或少量细胞上进行验证（另见“检查前验证”部分）。
家族致病变异和遗传标记（STR和/或SNP）
在开发针对单个或少量细胞的致病变异和STR和/或SNP分析时，提出以下建议：
• 理想的设计是将扩增子的大小设计为100至500 bp，并使用荧光染料的组合来区分基因座。
• 与嵌套式或半嵌套式PCR相比，单轮多重PCR更可取，因为它不易出错。如果可以的话，最好使用带有三、四或五核苷酸重复序列的STR，以减少由于伪带假象（stutter pattern）现象而引起的任何混淆歧义，并提高等位基因的区分度。
• 由于大等位基因的ADO风险甚至在基因组DNA水平上也会增加，因此建议避免使用等位基因大小范围变化很大的STR而在临床前检查和PGT-M期间导致假纯合基因型。
• 在进行单细胞验证之前，建议对当前检测的致病变异/野生型或标记等位基因进行正确的判别。建议使用以下DNA样品检测与目标致病变异或目标标记有关的各种基因型：
– 受影响的（常染色体显性）DNA样品；
– 携带者（常染色体隐性遗传、X连锁疾病）DNA样品；
– 未受影响的待测致病变异的DNA样品；
– 具有杂合标记的DNA样品，用于间接检测。
• 当对PGT-M使用程序时，建议对每对特定夫妇的DNA或单个细胞进行特异性检测，以发现任何意料之外的可能会使将来的卵裂球结果不可靠的检测结果（例如，多态性在单细胞分析中使用的引物下可能存在，但在常规实验室分析中却不存在）。
• 多态性标记应具有高度的杂合度，并产生清晰可解释的峰型，最好是基因内的。
• 使用基因外标记时，建议与目标致病变异保持1 Mb（~1 cM）的距离，以减少由于重组事件引起的误诊风险（平均而言，位点相距1 cM预期代表1％重组）。如果在1 Mb范围内没有合适的标记，则可接受但不建议2 Mb范围内的标记。这种情况可适用于大的基因或存在重复的情况下。
• 应考虑每个标记的重组误诊风险，在大基因和已知重组热点基因的情况下尤为重要。仔细选择目标致病变异两侧的标记可减少由于重组引起的误诊风险。
• 定义单细胞/少量细胞检测所需的信息标记的最小数量：假设每个位点的AF和ADO率的验证数据保持在5％以下，建议至少包括距目标位点近端的一个STR或三个SNP和距目标位点远端一个STR或三个SNP，以及致病变异位点（选择表I中等级1或2和表II中等级1的标记）。如果AF和ADO的比率在5％到10％之间，则应该进一步优化检测，或应包括更多的标记。如果最高等级的标记不足，则可以选择较低等级的标记进行检测开发，但此时应增加标记的数量。
• 更多标记将使检测更加可靠；对至少两个与该基因紧密相连并位于该基因两侧的基因座进行分析，将减少由于ADO而导致的无法接受的误诊的风险。而且，多重扩增中由于单个扩增子的AF而导致没有诊断的风险将降低。
仅遗传标记（STR和/或SNP） 对单个或几个细胞进行的靶向间接仅定向单倍型分析适用于：（i）排除检测，（ii）HLA分型，（iii）致病变异未知但已证明病灶/基因组区域是致病性的，（iv）三联体重复扩增（例如对单细胞扩增有抵抗力的脆弱的X智力低下1（FMR1）CGG重复延伸），（v）具有未知断点的大缺失/插入，（vi）如果无法直接进行致病变异检测[存在假基因、单细胞扩增不适用的富含GC的序列]或（vii）一般的连锁分析（以避免开发包括致病变异的检测）。间接检测方案仅适用于在临床前检查期间建立了高风险和低风险单倍型的情况（例外情况见“De novo致病变异”部分）。
通常，当开发使用STR和/或SNP对单个或少量细胞进行间接检测时，请遵循上一节中所述的建议（家族致病变异+遗传标记），除了所需的最低标记数量。
• 假设每个基因座的AF和ADO率的验证数据保持在5％以下，建议在感兴趣的基因座附近至少包括两个STR或六个SNP，并在感兴趣的基因座的远端包括两个STR或六个SNP（根据表I和II选择标记）。同样，在这种情况下，如果获得更高的AF和ADO率，则需要使用更多的标记，并且更多的标记将使检测更可靠。
• 如果感兴趣的区域位于中心区或端粒附近，则可能无法进行侧翼标记。此时建议将致病变异纳入检测方案，并将检测与TE活检相结合，以限制致病变异位点发生ADO的风险。应重新考虑由于重组引起的误诊风险。在特殊情况下，不可能进行侧翼标记，并且不能包括致病变异位点[例如，面肩肱型肌营养不良症（FSHD）]，该检测方案会与更高的误诊风险相关。应该就此类特殊情况进行深入咨询，并应解释是否需要进行产前检查（应在开始PGT程序之前确定其可行性）。
针对PGT-M和PGT-A组合的靶向扩增。在基于实时PCR的检测策略中，可以使用相同的活检样本同时分析PGT-M和PGT-A。工作流程包括四个步骤：细胞样品裂解、多重预扩增、实时PCR和分析。样品收集和细胞裂解后，对样品进行PGT-A和PGT-M的多重PCR预扩增。对于PGT-A，预先扩增了96个基因座，代表每个染色体的四个独立区域。对于PGT-M，根据临床前检查结果添加个性化的扩增子集。随后，通过实时PCR和相对定量，一式三份或四份地对预扩增样品的等分样品进行查询。通过该方案，只能检测到PGT-A的整个染色体拷贝数变化。可以应用自动化来简化该过程，使其可以在3-4小时内完成，并且与活检和遗传分析之后的新鲜移植兼容。
PGT-M靶向扩增之后的WGA。随着TE活检和玻璃化技术的发展，用于PGT-M的WGA的实践也随之增加。先进行单细胞或少量细胞的WGA，然后对有或没有致病变异的目标区域两侧的一组STR进行标准PCR反应的方法被广泛应用。使用SNP代替STR的方法已被描述，但是其临床应用非常有限。它正在被基于SNP阵列或基于NGS的单倍型所取代，因为这些方法允许以标准化方式评估多个SNP。
对于单细胞或少量细胞WGA中有关基础设施、设备、材料、装管和工作实践的的建议见“单细胞或很少细胞WGA”部分。并提出以下建议：
• 由于更好的基因组覆盖范围和较低的基因分型错误率，建议对单倍型应用使用基于MDA的WGA协议。
• 在临床前检查中，需要使用WGA产物作为模板DNA进行信息化/分离分析，以及进行基因座特异性检测法的开发。
• 建议针对活检细胞的数量对WGA方案和特定的下游检测进行验证分析，以确定AF、ADO和优先扩增的速率。
WGA之后的家族致病变异+遗传标记（STR和/或SNP） 通常，在开发用WGA进行单个或少数细胞的WGA检测再进行家族致病变异+STR和/或SNPs分析时，请遵循“PGT-M'的靶向扩增”部分的建议。
• 在单细胞水平上，WGA加多重PCR的ADO率要高于单细胞多重PCR的ADO率（20–30％）。对少量细胞的活检推荐应用WGA，因为ADO率将低于对单个细胞的活检。
• 单细胞活检是可以的，但是在定义下游检测所需的标记数量时，应考虑到较高的ADO风险。
• 定义少数细胞测试所需的最少信息量标记的最小数量：假设每个位点的AF和ADO率的验证数据保持在5％以下，建议至少包括一个STR或三个近端SNP，一个STR或三个SNP病原体变异位点（根据表I和II选择标记）。同样，如果获得更高的AF和ADO率，则需要更多的标记。
仅在WGA之后使用遗传标记（STR和/或SNP）。一般情况下，当使用单细胞或少量细胞的WGA进行检测再进行间接STR和/或SNP分析时，请遵循“PGT-M的靶向扩增”部分和上一段落[WGA之后的家族致病变异+遗传标记（STR和/或SNP）]。
• 在单细胞水平上，WGA +多重PCR的ADO率可能高于单细胞多重PCR的ADO率，在确认下游检测所需的标记数时应考虑到这一点。
• 确认少量细胞检测所需的全信息量标记的最少数量：假设AF和ADO率的验证数据保持在5％以下，建议至少包括距目标基因位点近端两个STR或六个SNP和远端两个STR或六个SNP（根据表I和II选择标记）。
• 在这里，如果获得了更高的ADO率，就需要更多的标记。
PGT-M遗传检测之后的WGA
仅用于PGT-M的SNP阵列。SNP阵列是包含多达几百万个探针的高密度寡核苷酸阵列，可在一次反应中跨所有染色体进行成千上万个选定SNP的基因分型。市售的SNP阵列使用各种方法对样品DNA进行SNP基因分型：与SNP等位基因特异性探针杂交或进行单碱基延伸反应是常用方法。既定平台具有预设数量的SNP，因此，目标区域内SNP的位置和数量将是固定的。阵列的扫描和SNP基因型的调用是基于总荧光和两个SNP等位基因的杂交强度比。
提出以下建议：
• SNP阵列需要相对较高的DNA输入，因此需要事先进行WGA步骤。
• 建议将基于MDA的WGA程序用于单倍型分析应用，因为与其他WGA方法相比，它具有更好的基因组覆盖范围和较低的基因分型错误率。
• 由于SNP阵列是通用平台，因此临床前检查仅需要针对目标位点进行信息性/分离分析；可以忽视位点特异性的开发。
• 建议针对活检细胞数对WGA方案和SNP阵列进行验证分析。在细胞级别，WGA和SNP阵列的无调用率和ADO率高于少数细胞级别，并且在确认目标区域所需的信息性SNP的最小数量时应考虑到这一点。
• 当使用已经由制造商验证过的市售SNP阵列程序时，仍建议在临床使用之前对整个湿实验室和干实验室工作流程进行实施验证。有关实施验证的具体建议，请参阅“检测前验证”部分。
• 从样品处理到数据分析的周转时间可能从24小时到几天不等，具体取决于设置和所选择的平台。建议每个实验室对简化程序的应用是否对杂交效率和数据质量有影响进行内部验证。
检测的局限性。SNP阵列单倍型分析需要携带突变伴侣者的至少一位一级亲属来进行相位检测，因为间接检测策略仅适用于在临床前检查阶段已确立了高风险和低风险单倍型的情况（例外情况见“De novo致病变异”部分）。
仅用于PGT-M的NGS。在NGS中，DNA聚合酶在DNA合成的连续循环中催化三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）的掺入。根据测序平台的不同，核苷酸掺入的每个循环之后都会释放出荧光团或氢离子。此过程可以大规模并行方式跨越数百万个片段/分子而进行。
在PGT-M的范畴下已经开发了几种方法，包括靶向基因位点特异性方法和基于基因组的通用单倍型方法。其中一些是可商购的。
提出以下建议：
• NGS需要较高的DNA掺入，因此需要先进行WGA步骤。
• 如果应用了长读测序，建议应用合适的WGA以确保扩增高分子量DNA。
• 鉴于基于序列的分析是一种通用方法，因此临床前处理仅需要信息性/分离检测；可以忽视位点特异性的开发。
• 建议针对活检细胞数量对WGA方案和NGS方案进行验证分析。
• 当使用已经由制造商验证过的基于NGS的商购程序时，仍建议在临床应用之前对整个湿实验室和干实验室工作流程进行实施验证。“检测前验证”部分中提供了有关实施验证的具体建议。
• NGS程序中的每个步骤都将影响数据集的整体质量。应在整个过程中建立质量控制（QC）指标，其中包括分析结合衔接子之前和之后的片段长度，以及在可能的片段大小筛选之前和之后对备好的文库进行定量，以确保在多重文库样本中呈现最佳的样品质量和DNA片段。应建立有关最终测序数据质量的QC指标。
• 应该采用样本的最佳索引，以确保在对序列数据进行多路分解（demultiplexing）时可以有效地区分不同的样本。
• 从样品处理到数据分析的周转时间可能从24小时到几天不等，具体取决于设置和所选择的平台。因此，可以在当前或后续周期中安排胚胎移植。
关于NGS的其它一般性建议，详见有关检测结构和数量染色体畸变的论文（ESHRE PGT-SR/PGT-A工作组等，2020）。
检测的局限性。NGS方法的主要局限性是它们产生的读取长度，长读测序技术解决了这一挑战，这种技术允许对单个DNA分子进行测序。
基于通用单倍型分型的方法需要至少一位一级亲属来进行相位检测。作为一种间接检测，此方法不适用于没有过孕育史夫妇的De novo致病变异检测（另见“De novo致病变异”部分）。
分析软件仅适用于某些已开发的方法。如果没有合适的软件，则需要保证有高技能的生物信息学家的参予支持，并且所用软件将需要进一步的验证。
WGA之后对PGT-M和PGT-SR/PGT-A组合的一般检测。全面的PGT是指PGT-M和PGT-A的组合。在这个方向上已有几种方法被开发出来。这些方法可以采用两种不同方法基于同一WGA产物进行并行处理，一种针对PGT-M，另一种针对PGT-A。或者使用全基因组方法能够同时进行单倍体分型和拷贝数变化的检测，从而可以在同一检测中同时进行PGT-M和PGT-A。这些通用方法可以是SNP基于阵列、基于测序或两者的组合。
提出以下建议：
• 当提供组合的PGT-M和PGT-A时，建议夫妇根据使用的方法，就可能的发现和对移植政策的后果接受全面的咨询。
• 不管中心特有的移植政策如何，建议如果进行分析后可获得无非整倍性的未受影响胚胎，则可给予优先移植。
• 应按照“WGA之后PGT-M的一般检测”部分中所述进行PGT-M的临床前检查。
• 这些方法也可用于PGT-SR中的遗传性染色体结构变异。取决于所涉及的片段的大小，对于目标区域，异常强度比可能检测到，也可能检测不到。如果可检测到，建议通过log R比和B等位基因频率值来支持诊断。
• 此外，即使使用市售平台，也建议进行实施验证，以测定或确认检测片段非整倍性的下限大小。这些值在平台之间可能有所
不同。建议使用来自已知核型的单个或少量细胞样品的WGA产物和/或使用先前验证过的方法诊断出的胚胎细胞的WGA产物进行验证分析。
关于PGT-A的更多建议被包含在关于检测结构和数量染色体畸变的论文中（ESHRE PGT-SR/PGT-A工作组等，2020）。
检测的局限性（对于PGT-M和PGT-A的组合）。
• 由于这些检测（对于PGT-M和PGT-A的组合）要求有定相参考，因此它们不适用于所有PGT-A指症。
• 并非所有方法都能检测到倍性变化；基于aCGH或NGS的方法不能可靠地检测所有类型的多倍性和单倍性（另见关于结构和数量染色体畸变检测的论文中的表I（ESHRE PGT-SR/PGT-A工作组等，2020））；SNP阵列和基于NGS的单倍体分析可以识别多倍性和单倍性。
• 减数分裂错误不能在所有情况下和通过所有途径与有丝分裂区分开来。
• 建议定义镶嵌检测的阈值。
检测前验证
对于PGT-M。
• 验证标准取决于活检细胞的数量（卵裂期为单个细胞，或囊胚期为少量细胞）以及PGT-M所用策略的类型。对捐赠给研究的胚胎细胞或其他细胞类型（例如外周血淋巴细胞）进行验证是可以接受的。
• 需要确定误诊风险。
• 以下标准适用于有靶向的基于STR的检测和变异分析，无论先前是否有WGA：
◦ 验证分析将确定扩增效率、准确性和ADO率。对于已知基因型的单细胞或少量细胞样品，准确度应>99％。
◦ 每个基因位点的扩增效率应>95％。大于90％的扩增效率是可以接受的，但需要包括更多标记。
◦ 每个基因位点的ADO率应小于5％。ADO率小于10％是可以接受的，但需要包含更多标记。
• 应验证基于靶向扩增的每种新检测。
• 对于靶向扩增，在临床使用前，应在50个单细胞或少量细胞样品中进行验证分析，分单独的两次或三次运行进行。对于更新的程序（即现有程序的改编），可以接受用较少的样本来验证。
• 如果先前已在单个细胞上验证过程序，则无需在少量细胞样品上进行再次验证。
• 以下标准适用于一般策略，例如先前有WGA的SNP阵列：
◦ 当使用已经由制造商验证过的市售SNP阵列或基于NGS的程序时，仍建议在临床使用前对整个湿实验室和干实验室工作流程进行实施验证（implementation validation）。
◦ 建议对来自已知基因型的单细胞或少细胞样品中的WGA产物和/或用先前验证过的方法诊断出的胚胎细胞中的WGA产物进行验证分析。
◦ 验证实验应至少使用50个WGA样品进行，理想情况下应涵盖各种指征。
◦ 验证实验要确定诊断所需的目标区域的扩增效率、准确性和遗传标记的最低数量。
◦ 对于高质量的样品，扩增效率应>95％（对于为研究/培训捐赠的胚胎的活检样品，这可能无法实现）。来自已知基因型的单个或少量细胞的WGA样品的准确度应>99％。同样，对于以前诊断过的来自胚胎细胞的WGA产物，与另一种经过验证的方法的一致性应>99％。
◦ 如果在临床上单细胞和少量细胞分析两者都要进行，则必须分别进行验证。
对于PGT-M和PGT-A的组合。
• 必须验证两个指征。同样，验证标准取决于活检细胞的数量（卵裂期的单个细胞，或囊胚期的少量细胞）以及所用策略的类型。对于PGT-M，适用上述建议。对于PGT-A，验证建议在有关检测结构和数量染色体畸变的论文中被描述（ESHRE PGT-SR/PGT-A工作组等，2020）。
• 一旦通过验证，对五种WGA产物进行临床前检查和PGT-M条件测试就足够了。
风险评估
对PGT-M误诊风险的评估取决于所遵循的分析策略。基因标记和致病变异的靶向扩增方案的残留风险必须考虑到侧翼标记与变异或目标基因之间的距离以及致病变异的ADO率。未检测到的重组或双重重组和致病变异的ADO可能导致误诊。当使用提供部分信息的标记时，重组可能不会引起注意，这意味着更高的残留风险。如果使用仅标记方案，则未检测到的重组或双重重组也可能导致误诊。
对于基于全基因组SNP阵列或基于NGS的单倍型分析策略，与传统的靶向扩增策略相比，残留风险可能更低。这是由于存在多个位于目标基因或基因位点侧翼的SNP，从而消除了单个标记ADO的影响。同样，通过使用多个SNP标记，重组事件的影响可能会在更小频率上导致不确定的结果。尽管如此，所使用的信息性SNP标记与基因的距离对于残留重组风险至关重要。
风险评估还应涵盖：
-由样品跟踪错误引起的风险；
- 在进行DNA分析之前处理活检样品时所引起的风险，如果不谨慎操作，可能会损害DNA的完整性；
- 由于实验条件欠佳（污染、ADO、ADI）或生物学原因（重组、双重重组、减数分裂或有丝分裂染色体异常）导致不确定或错误结果的风险；
- 意外结果的风险；
- 检测失败的风险（即标记和/或测序不足以生成诊断结果）。
临床前检查报告
有关PGT组织的论文（ESHRE PGT-SR/PGT-A工作组等，2020）中提供了临床前检查报告有关行政管理和患者信息的一般指导和建议。对于PGT-M，临床前检查报告还应包括检查总结，并详细说明临床周期的检测策略。
建议在报告中明确说明以下内容：
• 采用人类基因组变异学会（HGVS）的建议，进行指征和基因（若可能，提供OMIM编号）、致病变异的命名。
• 基因参考序列、基因组构建、遗传模式，使用STR时的多态性标记选择、信息性SNP数量、标记与基因或致病变异之间的距离，所有可得家庭成员的信息性检测结果、致病变异检测和连锁分析（取决于为PGT周期选择的策略）；
• 检测局限性和PGT误诊的残留风险，包括图形显示。
特殊病例
De novo致病变异
如果在一个伴侣或一个孩子中存在一个De novo致病变异，则必须在检测策略中包含突变检测。高风险和低风险单倍型的确定或定相只能在PGT周期内完成。
预期父母中的De novo致病变异。如果可以从受影响的后代获得DNA样本，则可以按照通常的PGT-M要求处理此病例。如果没有从受影响的后代获得DNA样本，则以下建议适用：
• 必须将突变检测包括在检测策略中，并且诊断将取决于突变的存在与否。突变位点的扩增失败不会生成诊断结果。
• 建议在临床应用之前尽可能尝试建立高风险和低风险的单倍型。如果是男性伴侣存在De novo致病变异，建议从单个精子分析中来定相。如果是女性伴侣存在De novo致病变异，也可以选择从PB中为De novo变异确立相位，但这可能更加复杂（需要额外的活检程序，并且从有可能存在重组的PB的单倍型推导卵母细胞中的单倍型）。也可以通过NGS对患病伴侣及其父母的疾病特异性扩增子进行长读取测序来推定相位。这将在发生了De novo变异的预期父母家族中，表征祖父母的单倍型。在临床周期中应确认高风险和低风险单倍型。
• 或者，可以在临床周期之前使用来自患病伴侣及其父母的DNA建立遗传标记单倍型，然后在PGT周期中完成定相。在只有预期父母的DNA样本可得的情况下，需要根据胚胎的基因型确定单倍型和定相。
如果在临床周期开始时定相未知，则以下建议适用：
• 必须在检测策略中包括致病变异检测。
• 建议进行TE活检以限制在致病变异位点的ADO风险。如果进行卵裂期活检，则应检测两个独立的细胞。
• 当可供活检的胚胎太少时，建议活检和分析未受精的卵母细胞（如果女性伴侣有致病变异）和/或不适合活检的胚胎，以支持定相。
• 理想情况下，至少需要一个受影响的胚胎和一个不受影响的胚胎才能确立正确的相位并检测重组事件。在相同的亲本单倍型情况下，应一致地检测致病变异。如果不可能，建议冷冻保存胚胎，并等待下一个周期的胚胎分析。应该事先告知夫妇这种可能性。或者，也可以在经过充分咨询后移植胚胎并强烈建议通过产前诊断进行确认。
• 在预期父母中，不能排除由于合子后De novo致病变异引起的生殖细胞嵌合，因此不建议使用未受影响的儿童/产前/胚胎样本作为定相参考。如果检测到镶嵌，则必须评估传播风险。
• 在预期父母中检测到的生殖细胞嵌合可能是体细胞嵌合的指征，反之亦然。在针对所测致病变异ADO率的PGT程序的单细胞验证中，使用这种个体的单个细胞可导致突变等位基因的ADO率增加，具体取决于镶嵌程度。
• 在单细胞分析后，由于ADO的风险，不建议移植携带有致病变异位点的野生型等位基因和由ADO风险引起的高风险单倍型的胚胎。在分析TE样品后移植此类胚胎是可以接受的。强烈建议后续进行产前诊断。
患病儿童的De novo致病变异。
• 当在儿童中检测到De novo致病变异时，重要的是要彻底咨询这对夫妇有关复发的可能性，并帮助他们做出明智的生殖选择。在开始PGT-M程序之前，应在所有情况下考虑实现妊娠和进行产前诊断。
• 对于儿童的De novo致病变异，是否允许使用PGT-M的决定可能会因当地法规而异。
• 建议在该夫妇先前受影响的孩子中排除De novo致病变异的合子后起源。在这种情况下，复发风险最小，应仔细评估使用PGT进行IVF治疗的可能性。对这对夫妇的生殖史的初步评估可能会提供父母中潜在的生殖细胞嵌合的证据，例如通过先前怀孕中反复传播的证据。如果从先前终止的病例中获得了DNA，则可以按照常规的PGT-M程序处理该病例。父母中潜在的生殖细胞嵌合的进一步证据可能来自对多种父母组织中致病变异的评估。如果检测到生殖细胞嵌合，则适用上节中有关预期父母的De novo致病变异的建议。
当血统中存在近亲关系时，可能有必要调整检测策略，尤其是在靶向扩增的情况下。
近亲祖父母。由于夫妇的父母之间的血缘关系，预期的父母可能在目标区域具有两种相同的单倍型，并且可能很难在1-2 MB侧翼区域内找到信息丰富的遗传标记。如果是常染色体显性遗传疾病，则应在检测策略中包括致病变异分析，并且验证后致病变异基因位点的ADO率应较低（TE样本分析优于第3天的两细胞分析）。如果是常染色体隐性遗传病，则应基于夫妇双方的低风险单倍型来进行诊断。
近亲夫妇。如果预期父母共享常染色体隐性遗传性疾病的高风险单倍型，则纯合子受影响的胚胎中的父母污染（多数为母源）无法与携带者的胚胎区分开，这可能会导致移植受影响胚胎的不良误诊。建议通过分析非连锁的信息多态性标记或对两个独立的活检样本进行分析来适应检测策略。如果不这样做，则与携带者胚胎相比，优先转移健康胚胎是可以接受的。
在WGA之后使用SNP标记时，可以检测到父母污染。
HLA分型
对植入前胚胎进行HLA检测的目的是建立一个与HLA兼容的、与需要造血干细胞移植的患儿兼容的胚胎的妊娠。造血干细胞是从出生的HLA匹配供体兄弟姐妹的脐带血或骨髓中收集到的（或两种来源的组合），并用于移植和治愈受影响的兄弟姐妹。有关PGT组织的论文（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）中讨论了在开始PGT-HLA步骤之前的咨询建议和重要考虑因素。以下建议也是相关的。
检测策略。
• 首选的PGT方法是间接HLA单倍型分析（使用STR标记或全基因组SNP单倍型分析），这涉及对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR和HLA-DQ区域两侧的遗传标记进行连锁分析，以确定受试胚胎和患儿之间的匹配单倍型。
• PGT程序必须在以下每个区域中至少包含一个完整的信息标记：HLA-A的端粒、HLA-A和HLA-B之间、HLA-B和HLA-DRA之间、HLA-DRA与HLA-DQB1之间和HLA-DQB1的下游。必须指出的是，在HLA-DRA和DQB1之间标记的寻找遇到了困难。在这种情况下，必须包括位于
