摘要：植入前基因检测（PGT）领域发展迅速，而最佳实践建议对于诊断检测的规范和标准化至关重要。在2005年和2011年发表过的ESHRE关于PGD最佳实践的指南被认为已经过时，因此有必要撰写新的论文来概述PGT的良好实践建议。本论文提供了有关用于染色体结构变异的PGT（PGT-SR）和非整倍体的PGT（PGT-A）技术方面的建议，并涵盖了基于微阵列的比较基因组杂交（aCGH）和下一代测序（NGS）的建议用于PGT-SR和PGT-A以及用于PGT-SR的荧光原位杂交（FISH）和单核苷酸多态性（SNP）阵列，包括实验室问题、工作实践控制、预检验验证、临床前检查、风险评估和局限性。此外，围绕培训和一般风险评估以及检测和检测后过程，提出了一些有关PGT-SR/PGT-A的常规建议。本文是关于PGT良好实践建议的四篇论文之一。其他论文报道了PGT中心的组织、胚胎活检与输卵管以及用于单基因缺陷（PGT-M）的PGT技术方面的内容。
总起来，这几篇论文可帮助每一位想了解PGT在最好的实验条件与临床实践潜力方面的走向。ESHRE页面内容没有经过外部同行评审。本文已被ESHRE执行委员会的授权发表。
关键词：
这对患者意味着什么？
本文概述了植入前基因检测（或PGT）的良好实践建议。在2011年曾发表过类似的文件，但是这方面文献需要更新为当前IVF和遗传学实验室中使用的新技术。
这些建议应帮助实验室人员和遗传学家基于最好的实验室和临床实践来开展PGT。本论文在检测染色体畸变和非整倍体PGT（以前称为PGS）的技术方面提供了建议。染色体畸变是指正常的染色体发生了大小或排列的变化，染色体是储存我们遗传物质的结构。检测的目的是选择“正常”胚胎，从而提高健康妊娠率。
这些技术建议并非与患者直接相关，但应确保PGT患者获得最佳护理。
免责声明
此良好实践建议（GPR）文件代表了ESHRE的观点，这些观点是ESHRE相关利益方之间达成共识的结果，并基于准备时可获得的科学证据。
ESHRE GPRs应该用于信息和教育目的。它们不应被解释为制定护理标准，也不应被视为包括所有适当的护理方法，也不应该被视为排除合理的旨在获得相同结果的其他护理方法。它们并不能代替将临床判断应用于每个个体表现的需求，也不能替代基于地点和设施类型的变化。此外，ESHRE GPR并不构成或暗示对所列举的任何ESHRE推出的技术的认可或赞成。
在对不育症护理中使用的术语进行修订之后，先前的植入前基因诊断（PGD）和植入前基因筛查（PGS）术语已被植入前基因检测（PGT）取代（Zegers-Hochschild等，2017）。PGT被定义为执行一项检测，即分析卵母细胞（极体）或胚胎（卵裂期或囊胚）的DNA，以进行HLA分型或确定遗传异常的检测。这包括用于非整倍体的PGT（PGT-A），用于单基因缺陷的PGT（PGT-M）和用于染色体结构重排的PGT（PGT-SR）（Zegers-Hochschild等，2017）。 ESHRE PGT学会收集的数据中，PGT-SR包含用于高遗传风险染色体数目畸变的PGT。
PGT始于1990年代，是一种实验方法，最初是基于聚合酶链反应（PCR）的方法进行性别选择和检测单基因疾病。几年后引入了相间荧光原位杂交（FISH），并成为了对胚胎进行性别鉴定以及检测数目和结构染色体畸变的标准方法。在过去十年中，全基因组技术开始取代FISH和PCR的金标准方法，这一趋势对于PGT-A最为明显。PGT-A主要用于体外受精（IVF）患者，其最初目的是提高每次胚胎移植的怀孕率和降低流产率。最近增加了其他结果指标，例如增加选择性单胚胎移植和减少怀孕时间。被引用的PGT-A的适应症包括高龄产妇（AMA）、复发性植入失败（RIF）、严重的男性因素（SMF）以及患有复发性流产（RM）的正常核型夫妇。对于所有IVF患者和/或合适的患者选择而言，该方法的价值仍在讨论中，但这不在本文的范畴之内（Harper等，2018）。
本系列文章的目的是提出适用于所有PGT服务的最佳实践，包括PGT-A以及PGT-M和PGT-SR。
为了使PGT达到与常规基因检测相同的高质量水平，一些学会已经设计了最佳实践指南。PGD国际学会起草了一些指南（2008，2004），而美国生殖医学学会则综述了美国的PGT实践（辅助生殖技术学会执业委员会和美国生殖医学学会执业委员会，2008）并发表了一些关于囊胚培养、胚胎移植和PGT-A的评论性文章。ESHRE PGT学会的第一份指南于2005年发表，因为该学会的任务之一是实现整体标准化并提高质量标准（Thornhill等，2005）。ESHRE PGT学会继与细胞遗传学欧洲质量评估（CEQA）和英国国家外部质量评估服务（UKNEQAS）合作之后，现在又一起与基因组学质量评估（GenQA）合作启动了外部质量评估（EQA）计划以提供独立的评估实验室，并帮助他们改善技术和报告。对原始指南的回顾提出了关于PGT不同方面的四组建议：一组关于PGT的组织，三组与所用方法有关：胚胎活检、基于扩增的检测和基于FISH的检测（Harton等，2011a，Harton等，2011b，Harton等，2011c，Harton等，20lld）。考虑到PGT服务提供的快速变化，现在正在更新和扩展这四个指南。在这些更新的指南中，执行诊断的实验室将被称为PGT中心，执行IVF的中心将被称为IVF中心。
PGT的一般方面，包括患者选择，咨询，怀孕以及儿童随访和转移PGT，将在有关PGT组织的论文中介绍。关于胚胎活检和输卵管的技术建议将在关于胚胎活检的论文中介绍。关于基因检测的建议将在有关数目和结构染色体畸变以及检测单基因疾病的论文中介绍。不同论文的内容与图1中的IVF/PGT临床过程一致。
ESHRE PGT学会认识到，由于地方或国家法规和具体实验室操作的差异，PGT的实践方式仍将存在差异（从最初的体外受精治疗、基因检测到妊娠、分娩和产后幼儿随访）。这并不会阻碍基于经验和现有证据，为提供最佳实践方案而提出一系列共识性建议。这些建议并非旨在作为唯一批准的实践标准，也不具有法律约束力。个别患者的个性化需求可能需要偏离这些建议，因此必须用专业判断根据患者的个性化需求来应用这些建议。但是，建议和意见可用于制定法律和法规，且从业人员应确保其遵守本国的法定要求或临床实践指南。本文为保持简洁明了，已尽可能去除重复，并包括许多交叉引用。因此，建议在寻求有关PGT问题的指导时，不要单独地参考这些论文中的一篇，而应始终把这些论文当作一个系列来参考。
材料与方法
本文是根据针对ESHRE良好实践建议的已发表论文而编纂的（Vermeulen等，2019）。有一个工作组由在所述技术上具有实操经验的人员组成，旨在代表不同的环境背景和国籍。工作组成员评估了以前的指南（Harton等，2011c），并起草了本文的主要内容。由于本文目的是提供技术指南和支持，正式文献检索被认为并不重要，因此，除参考其它指南文件外，未添加任何参考文献。所有小组成员都根据自己的专业知识写了一个部分，随后与整个小组深入讨论，直至达成共识。共有11次线上会议被组织进行讨论。本文的终稿与该系列其他文件的一致性已被仔细确认。然后将终稿提交给参与方进行审议；本文于6月10日至7月10日在ESHRE网站上发表，并邀请ESHRE成员发表评论。工作组查验了所有评论，在一次线上会议上进行了讨论，并将有价值的评论整合进了本文的最终版。审议报告已被发布在ESHRE网站上。
为了便于使用本文中的建议，在术语表（补充表SI）中解释了粗体和斜体的术语，并列出了缩写（补充表SII）。
图1 IVF/PGT过程概述，以及所有方面的讨论与四篇建议性论文中的对应关系。IVF：体外生殖，PGT：植入前基因检测。
结果/建议
PGT-SR/PGT-A技术简介
本本文为PGT-SR的最广泛应用方法提供了详细的技术建议，包括荧光原位杂交（FISH），基于微阵列的比较基因组杂交（aCGH），下一代测序（NGS）和单核苷酸多态性（SNP）微阵列，对于PGT-A，包括基于全基因组扩增（WGA）的aCGH和NGS。本文还涵盖了有关SNP微阵列用于单基因疾病检测的的详细技术建议（ESHRE PGT-M工作组等，2020）。
本文阐述了有关PGT-SR和PGT-A的一般建议，这些建议与所采用的测试方法无关。
培训和人员
•基因测试程序应在（细胞）遗传学家、能胜任或能进行临床诊断的权威专家监督下进行。
•所有进行基因测试的人员均应按照临床分子细胞遗传学实验室的要求进行充足的培训，并应遵循书面的标准操作程序（SOPs）。
•应记录每种技术的培训。
◦关于吸管转移的培训在有关PGT的极体（PB）和胚胎活检的论文中进行了讨论（ESHRE PGT学会和SIG-胚胎学活检工作组等，2020）。
◦对于FISH，培训应至少达到临床细胞遗传学实验室常规测试所需的标准。建议每个学员在临床前培训期间至少成功布施或固定30个样本并进行FISH。有监督的临床培训应至少再额外加20个样本。
◦对于aCGH和NGS，建议至少对30个样本进行WGA，然后由每个受训者在临床前培训期间进行aCGH或NGS。有监督的临床培训应至少再额外加20个样本。
实验室基础设施、设备和材料
关于基础设施、设备和材料的一般方面包含在PGT组织的论文中（见ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。
标签和目击
关于标签和目击的一般指南包含在有关PGT组织的论文中（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。
风险评估
•当收到的待测样品是次优样品或不满足内部要求的样品（例如裂解的细胞、细胞核不可见）时，应将其记录归档，并应制定有关如何对这些样品进行后续处理的步骤。
具体对于PGT-SR来说：
•对患者的风险评估应包括因未能检测到不正常的分离产物而可能产生活的不正常后代的潜在风险数据。
•如果只能检测到两个易位片段中的一个，则不能识别所有可能的不正常分离产物。一项无法检测所有片段以及可能的不正常产物的测试，在降低活的不正常后代风险、早孕流产和死产风险方面的效果可能会有所欠缺。这应该在临床前检查报告中提及。
特定检测的适当指征
建议将PGT的具体指征保留在各个诊所范围内。
•由于FISH仅可用于测试一部分染色体，故不建议将其用于PGT-A，并且现在已有了更好的综合分子学方法来对所有的24条染色体进行非整倍体检测。
•不可出于社会原因对胚胎进行性别选择。
用于染色体结构重排的PGT
结构性染色体重排构成了PGT的主要指征类别。结构染色体重排有不同类型：相互和罗伯逊易位、插入易位、缺失、重复和倒位，所有这些都可能是遗传下来的或新产生的。家族相互和罗伯逊易位是染色体结构重排（PGT-SR）PGT的最常见指征。
在家族重排的情况下，PGT-SR提供了在胚胎发育的最早阶段诊断染色体不平衡后代的机会。PBs的孕前检测提供了一种间接鉴定染色体不平衡卵母细胞的方法。
有好几种方法用于执行PGT-SR，其中包括FISH、aCGH和NGS。PGT-SR胚胎活检主要在卵裂期（受精后第3天）或囊胚期（受精后第5-7天）进行。PGT-SR在PBs上的应用较少，涉及的分析方法也有所不同，因为卵母细胞（及相应的胚胎）的基因组信息是从第一次和第二次PB（非直接检测）的基因组信息推断得出的。有关基于PB的PGT详细信息可参阅Magli等（2011）和Geraedts等（2011）的论文（Geraedts等，2011，Magli等，2011）。
基于FISH的PGT-SR
基于FISH的PGT主要针对遗传的染色体重排，但也可以用于鉴定胚胎性染色体X-连锁疾病（如果不适合用直接突变检测）的胚胎性别鉴定（PGT-M）。
FISH能逐一列出与结构变异有关的染色体位点或指示性染色体的染色体位点。基于信号评分，能鉴别出染色体异常或胚胎性别，然后可以选择正常的胚胎或未受影响的性别的胚胎进行移植。
FISH技术的劣势在于其技术手段本质：诊断是基于目测检查的荧光信号，从而使DNA完整性的丧失和信号的重叠成为两个主要的问题。此外，基因组信息限于所用探针靶向的基因位点。因此，基于FISH的PGT用于涉及染色体小片段或亚端粒区的重排是可行的，这些重排很难或无法用其它方法检测到（例如<10 Mb的情况）。
实验室问题。FISH技术的原理是基于使用标记有独特荧光染料（直接或通过半抗原间接）的DNA特异性探针。将DNA探针和靶DNA（通常是胚胎间期核）同时变性并使其退火。杂交后，通过荧光显微镜观察结果。
目前许多经过改动的FISH方法版本已被发布，并且所有经过恰当验证的方法都可采纳。使用的方法应该都已事先在PGT中心经过实操、测试并验证过。
FISH程序：结构重排。对于结构重排，建议探针组至少包含足够的探针，以检测所有预期的属于染色体重排的变异。对结构变异携带者的预测分离结果的分析应包括对染色体配对的合理机制的评估，以及在第一次和第二次减数分裂后的分离产物。
对于更常见的双向相互易位，建议使用三种信息探针的组合（相对于易位断裂点的两个远端探针和一个近端探针，或两个近端和一个远端探针）来检测所有异常分离产物。对于罗伯逊易位和倒位，两种探针就可以。对于缺失、重复和插入，应使用靶区定位特异性探针，并且在诊断周期中应包含对照探针。
如果没有合适的探针，可以使用不能检测到某些不平衡形式的重排的探针组合，前提是已评估它们在可识别的妊娠中不可行或患病率很低。在（预验证）报告中必须提及，存在无法检测到的不平衡形式，应告知患者这一情形。细胞遗传学家或具有相当资质的人员应决定使用哪种探针组合。
对于卵裂期胚胎，单核卵裂球的PGT诊断用来检测染色体重排是可以接受的，前提是有能针对至少两个不平衡片段的产物信息探针，这些产物被认为在可识别的妊娠中可能普遍存在或能生长发育。如果只有一种信息探针可用于所涉及的染色体失衡，并且认为这种失衡可能在可识别的妊娠中普遍存在或能生长发育，则建议基于两个单核卵裂球的一致结果进行PGT诊断。
对于孕前PGT诊断，两次PBs都需要进行分析，并且减数分裂分离的所有不平衡产物都应该被检测到，以便获知卵母细胞所含的信息。但是，必须指出的是，由于第一次减数分裂中可能发生交叉互换数量不均等的现象（在FISH中无法检测到），因此针对PBs的PGT-SR可能会造成对结构重排携带者的错误诊断。附着于透明带（ZP）上的卵丘细胞的存在会严重影响PGT-SR分析的结果。
基于FISH的PGT诊断的囊胚活检是可行的，但要特别注意避免细胞重叠。滋养外胚层（TE）样品平均包含5-10个细胞，理论上可以进行更可靠的诊断。然而，由于技术故障（次优FISH条件）或真实的染色体嵌合，多细胞特性含有在不同细胞中产生不一致结果的可能性。应规范对不一致结果的报告，并应向对应的夫妇提供遗传咨询，解释对PGT诊断可靠性的可能影响。
可以使用其它探针来筛选与染色体重排无关的染色体的非整倍体性。如果应用了多轮FISH，则指示变异的探针应包含在第一轮中。
FISH程序：针对X-连锁疾病的性别鉴定（PGT-M）。对于胚胎性别鉴定，建议探针组至少包含对X、Y染色体及一个常染色体的着丝粒区域具有特异性的探针。
使用其他探针筛选常染色体非整倍性是可以接受的。如果应用多轮FISH，则在第一轮中应包括指示胚胎性别（X和Y）的探针。
在单个单核细胞上进行的PGT诊断对于性别鉴定是可以接受的。
应该注意的是，与基于扩增的针对沿性别遗传的与疾病相关的突变诊断相比，基于FISH的PGT性别鉴定以排除X连锁疾病的遗传可能缺乏优势。基于单倍型的诊断可以识别未受影响的男性和女性携带者。
周转时间。基于FISH的PGT-SR的周转时间取决于所分析的胚胎数和应用的杂交轮数。根据商业探针制造商的建议，每轮杂交的时间至少应为4 h，但实验室可以制定并验证自己的程序，从而在保持荧光信号强度和亮度的同时缩短杂交时间。因此，可以在4-48小时内从样品固定到信号评分获得临床周期报告。
档案。患者档案应包括相关的实验室档案：
-高分辨率（550-800条带）的亲本核型，最好通过FISH验证涉及结构重排的染色体区域；而且，它可以包括一名病患儿或其他家庭成员的核型；
-之前的任何不平衡妊娠或着床前胚胎的细胞遗传学分析结果；
-遗传咨询报告，其中包含有关PGT-SR的建议，检测方法的表征以及检测的益处和局限性；
-夫妻双方关于风险评估和检测表征局限性的知情同意。
实验室基础设施，设备和材料。
基础设施。以下是对实验室空间的建议。
•实验室应通风良好，以减少任何有毒烟雾的影响。当使用甲醇和乙酸固定细胞时，这一点尤其重要。在这种情况下，建议使用通风柜进行固定。
•FISH的结局，包括细胞的扩散和固定，取决于湿度。FISH实验室的湿度应被稳定控制。在这些条件下应优化FISH程序。
•在强光下，FISH信号可能会被漂白或减弱。建议FISH实验室配备可变强度的白炽灯。可也可用荧光灯照明。载玻片应被冷藏保存，并放在不透光的存储盒或纸夹中。
设备。
•基于FISH的PGT诊断需要以下设备：配备有适用于所用荧光染料的过滤器的荧光显微镜、水浴和杂交装置。应优先使用荧光图像捕获系统来记录FISH图像。
材料和试剂。
•所需的材料是载玻片和盖玻片，以及对于感兴趣的染色体结构变异具有特异性的探针组。
•在杂交及杂交后的步骤中，应避免日光。
•建议使用商业化的探针，因为它们一般有质量控制（QC）和检验报告。
•如果有合适的前临床质量保证（QA）/QC和验证，选用自制的探针也是可以的。
建议在临床前对所有探针瓶进行测试应用程序，以确认它们包含正确的染色体特异性探针并标有正确的荧光染料或半抗原。此外，建议使它们能为有意向做PGT-SR的夫妻提供丰富的信息，并达到文献中可接受的信号特异性、亮度和离散性水准。批号应被记录下来以保障可持续的追踪性。
建议仅具有适当资质的人员（如书面资格证书清单中所列的）授权选择用于临床的探针。
•如果发生罗伯逊易位，则可以使用荧光探针检测与变异有关的两个近端着丝粒染色体长臂上任何基因位点。对于相互易位，可以使用指示易位区域的α-随体探针、位点特异性探针或亚端粒探针。对于倒位，通常使用目标染色体的短臂和长臂的位点特异性探针，并可能与α-随体重复探针结合使用。对于缺失、重复或插入的检测，优先选用指示靶染色体区域的位点特异性探针，并与对照探针（α-随体或亚端粒探针）结合使用，以区分真正的缺失/重复与整个染色体拷贝数的变化。
•建议在每轮FISH中，所有探针都用不同的荧光染料或荧光染料组合标记，以便可以区分不同探针信号的颜色。信号之间应相隔一个域。
•当使用预杂交步骤（例如胃蛋白酶和聚甲醛）时，建议采取措施以确保对这些溶液进行适当的质量控制（QC）。在每轮FISH中使用之前，溶液的温度范围和pH值应改被验证。应记录所有步骤的溶液生产日期，并应在使用前检查溶液中是否存在细胞污染。
•建议使用包含抗褪色的防固剂（带或不带DAPI，取决于探针组合），以保持荧光信号。建议在每个FISH程序、变性和杂交之前，都要验证溶液的pH值和洗涤温度。
工作实践控制。
识别与目击。
•建议使用适当的书面或条形码（电子）标签系统，使用两个唯一的患者和胚胎/细胞标识符。
•应由独立的观测者（最好是经过FISH培训的人员）对关键步骤和高风险步骤进行标签确认和样品识别。建议由两名操作员在活检、样本收集和基因检测期间目击并签署唯一的患者识别符和胚胎/细胞编号[另请参见有关PGT组织的论文（详见ESHRE PGT学会筹划指导委员会等，2020年）]。FISH程序的以下步骤也需要目击者：
-在准备探针时，要检查是否使用了正确的FISH探针（应事先正确标记患者个性化的经过预先验证的探针混合物），
-在记录诊断性FISH结果时要确保FISH图像对应于正确的细胞和/或胚胎。
•可以记录载玻片上固定/分散细胞的位置，以利于跟踪。
批内对照。可以考虑在基于FISH的PGT诊断中使用阳性和阴性对照。
•尚无合适的阳性对照（即不平衡的单个人类卵裂球、TE细胞或其他类型的细胞来代表不平衡的人类卵裂球或TE细胞）。
•正常或携带者的中期淋巴细胞可作为对照，以确保杂交混合物中的探针可识别预期的染色体/染色体区域。
检测前的过程。检验前过程包括临床前检查，测试开发和验证。
临床前检查和测试开发。
•建议进行临床前检查，以评估PGT-SR的可行性，鉴定信息丰富的探针并制定临床检测策略。建议对预期的结构变异进行隔离分析，以确保测试策略可检测出胚胎中所有预期的基因型。
可以对雄性易位携带者的精子细胞进行FISH测试，以尝试预测PGT-SR在这些情况下的疗效。
当使用先前已显示过具有极低多态性比例的探针组时，可以放弃任何临床前检查。其他探针可能更倾向于多态性，因此建议对外周血淋巴细胞进行临床前测验。1、9、16号染色体和Y染色体的异染色质区域中的序列密切相关，因此经常观察到这些染色体之间的交叉杂交。此外，第15号染色体短臂上的DI5ZI区易与其它近端着丝点染色体特别是第14号染色体的短臂区交叉杂交。此外，着丝粒探针DIZ7（1号染色体）、D5Z2（5号染色体）和DI9Z3（19号染色体）偶尔显示交叉杂交。最后，18号和16号染色体着丝粒的特异性探针之间的信号重叠也经常遇到。
•应遵循固定程序并在每轮FISH之后检查细胞的位置和完整性。
检测前验证。
•建议同时对染色体重排携带者和其伴侣进行验证，但仅对携带者验证也是可以接受的。在临床PGT-SR检测之前，对于捐赠用于研究的胚胎的卵裂球和TE细胞进行验证是可以接受的。对其它类型的细胞进行验证也是可以的，例如外周血淋巴细胞和成纤维细胞。
•建议至少检查10个中期扩散：（i）确保探针对正确的染色体具有特异性；（ii）评估染色体多态性和信号交叉杂交；（iii）关于染色体重排的携带者，要确保探针与预期的重排区域杂交。
•此外，建议使用适当的评分标准（依据信号特异性、亮度和离散性）对至少100个间期细胞核进行评分。
•建议至少检查10个中期扩散：（i）确保探针对正确的染色体具有特异性；（ii）评估染色体多态性和信号交叉杂交；（iii）关于染色体重排的携带者，要确保探针与预期的重排区域杂交。
•此外，建议使用适当的评分标准（依据信号特异性、亮度和离散性）对至少100个间期细胞核进行评分。
•对于每个实验室的每种FISH探针和探针组，应该确定FISH杂交效率的可接受范围。验证测试应至少保证探针能够按预期进行杂交，能得到重排的大量信息，并且每种探针使用时能有> 95％的细胞显示预期的信号数量。
•建议提前确定评分标准（已公开发表或“内部”的），并应遵循这种书面程序。
临床前检查报告。有关PGT组织的论文中提供了临床前检查报告的有关管理和患者信息的一般指导和建议（见ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。临床前检查报告还应包括PGT-SR检查的总结，总结应包括程序和验证步骤的详细信息。它应进一步阐述所用的FISH探针以及杂交效率、探针组的假阳性率和假阴性率。如果适用，可以使用国际人类细胞遗传命名系统（ISCN）/人类基因组变异学会（HGVS）命名系统的最新版本。最后，报告应包括检测的可能的缺陷。
风险评估。风险评估应阐述：
-由样品跟踪错误引起的风险；
-在FISH分析之前处理活检样品时所引发的风险，如若操作不慎，可能会损害DNA完整性；
-由于实验条件欠佳而导致不确定或错误结果的风险；FISH诊断的可靠性可能受到无法准确解释信号，不一致的固定或次优杂交的负面影响；信号重叠可能导致低估实际染色体（区域）的拷贝数；此外，与α-随体探针相比，位点特异性和亚端粒探针产生的信号亮度更小，并显示出更高的分割信号率，从而降低了正确信号评分。
-由于生物学原因导致不确定或错误结果的风险：
(i)在第一次减数分裂期间，交叉可能会导致均衡分配到染色体重排携带者的配子中；
(ii)无论是卵裂期还是囊胚期的染色体嵌合现象都可能会导致对实际胚胎核型的错误解析；
-患者有流产、死产、（存活的）不平衡后代、染色体嵌合后代或有与用到的检测无关的染色体失衡，无论是生物学上的还是由技术错误引起的。
•测试的局限性。FISH技术的局限性应在临床前检查报告中明确提及和/或在遗传咨询期间与患者讨论。
基于FISH的PGT-SR分析无法区分具有正常核型或平衡核型的胚胎。
•基于FISH的PGT-SR分析无法检测单亲二体性（UPD）。
•基于FISH的PGT分析只能评估所用DNA探针的目标染色体的拷贝数。
由于可用的荧光染料数量有限，因此可以同时检测的染色体数量也受到限制。因此可能需要连续数轮的FISH，这会对DNA完整性和信号质量产生负面影响。
•商用探针仅可用于有限数量的基因位点，这可能会使用于分析罕见染色体重排的探针的选择复杂化。
•如果在单细胞活检中进行FISH，则无法检测嵌合现象
基于阵列的PGT-SR
•aCGH涉及在带有固定DNA探针的显微镜载玻片上差异标记样品和参考DNA的竞争性杂交。DNA探针对应于特定的染色体区域，并占据载玻片上的离散位置。每个位置的颜色由杂交后两种颜色的荧光比得出。荧光比的评估是自动化的，可指示染色体的丢失或增加。
•与FISH相比，微阵列被认为是PGT-SR的更可靠方法，因为它们为每个易位片段提供了多个测量点。此外，它们允许同时评估不参与重排的染色体的拷贝数。
•目前正在使用的商用微阵列平台有两种类型。第一种是基于寡核苷酸的aCGH平台，可提供5至10 Mb的分辨率。第二种是基于寡核苷酸的单核苷酸多态性（SNP）微阵列平台，提供2.4至5 Mb的分辨率（另见有关检测单基因疾病的论文（ESHRE PGT-M 工作组等，2020）。
实验室问题。aCGH工作流程涉及（i）样品细胞裂解和WGA；（ii）用不同的荧光染料（例如绿色和红色）标记样品和参考DNA；（iii）纯化标记的DNA；（iv）微阵列处理（将活检样品和参考DNA样品杂交，然后洗涤微阵列载玻片）；（v）扫描；（vi）扫描微阵列tiff图像的分析，其中数据被提取到荧光比率。通过特定软件计算得到的荧光比率的log2，以识别结构和数字化的的染色体拷贝数畸变。
aCGH程序。
•建议为aCGH工作流程中的所有步骤建立湿实验室实验条件，然后进行临床前评估，以检测染色体畸变的准确性。
•可以对PB活检执行基于aCGH的PGT-SR，前提是可以分析两个PBs，并且可以检测到所有不平衡的减数分裂分离产物，从而有可能知道卵母细胞的信息。但是，必须指出的是，由于在第一次减数分裂种发生的交叉互换数目可能不均衡，对PBs进行的PGT-SR对结构变异的携带者进行误诊的风险较高，而这可能无法通过aCGH检测到。附着在ZP上的卵丘细胞的存在会严重影响PGT-SR分析的结果。
•在单细胞活检上进行基于aCGH的PGT-SR是可行的，尽管它们总体上会增加噪音并在aCGH谱中显著改变染色体伪影。噪声水平的可接受标准应作为QA / QC参数的一部分。
•基于aCGH的PGT诊断的囊胚活检可提供更可靠的诊断，因为一个TE样本平均包含5-10个细胞。
•建议使用与用于验证的特定aCGH平台兼容的WGA程序。
周转时间。从样品处理到全面染色体分析的净aCGH周转时间为24小时，尽管可能在8-12小时内获得结果。但是，每个实验室都需要验证较短的杂交时间是否会影响杂交效率。
文档。有关实验室文档应包括：
-患者的核型，如果能得到断点的FISH验证，最好是高分辨率的（550-800谱带）；
-关于以前任何异常的受孕子代的报告；
-遗传咨询报告，其中可能包含有关PGT-SR的建议、检测方法的指示以及检测的优缺点；
-夫妻双方对于风险评估和检测局限说明的知情同意。
实验室基础设施、设备和材料。
基础设施。
•为了防止遗留被扩增的DNA，实验室空间应划分为物理分离的扩增前和扩增后室。
•扩增前和扩增后室/区域应最好配备UV-C灯以消除DNA污染。
•建议在扩增前室中使用正气压。当存在正压室和负压室时，它们最好用一个锁着的腔室封闭。
•应在每个指定区域使用专用的设备、消耗品和实验室外套，并且不得在扩增前和扩增后室之间混用。
•扩增前步骤应在垂直层流柜中进行。扩增前和扩增后区域之间的工作流程应是单向地从扩增前室（无尘室）到扩增后室。
建议在所有步骤中对环境条件（臭氧、温度和湿度）进行恒定调节，以确保有效的杂交结果
设备。
•活检样品的WGA和aCGH分析所需的设备包括：
-一个II类安全柜，最好配备UV-C灯，以防止在扩增前阶段污染样品；
-带加热盖的热循环仪（一个用于扩增前室，一个用于扩增后室）；
-微量离心机（一个用于扩增前，一个用于随后的所有阶段）和一台台式摇摆式离心机；
-一个磁力搅拌器、通风柜、杂交箱/培养箱、水浴、凝胶电泳设备（检查扩增是否成功）和涡旋混合器；
-配有相应激光器的激光扫描仪，用于激发杂交的荧光团以读取和存储杂交的结果图像，将其放置在扩增后室中，该房间应保持臭氧参数低，温度可调节且不受日光照射，且被验证并调整为特定PGT程序所需的分辨率。
•DNA定量系统（用于确定WGA之后扩增的DNA的量）和真空浓缩仪（用于减少处理大量样品所需的时间）的使用是非必需的。
•还应在适当的条件分配关联的服务器，并且关键步骤中使用的仪器应连接UPS。
•在方案的每个步骤之前，建议先验证设备和溶液的温度范围和/或pH值。应在各个设备的PGT中心对特定的温度和热循环程序进行验证，并应定期维修和校准仪器以确保准确性。
•软件自动调用结构异常并不总是能实现，因此，常需要由操作员手动调用节段性非整倍性。
•材料。活检样品的WGA和aCGH分析所需的材料包括：
•特异针对每种扩增方法的细胞裂解、预扩增以及扩增酶和缓冲液；
•DNA标记反应缓冲液、酶、dNTP和荧光团标记的dUTP，由于它们对光敏感，因此应在最小曝光量下使用；
-杂交和冲洗缓冲液、人Cot-1 DNA和不含DNase/RNase的蒸馏水；
•微阵列载玻片。
工作实践控制。
•识别和目击。
•建议使用一个带有两个独特患者标识符和胚胎/细胞编号的适当标签系统。
•应由一名独立的观察员确认标签和样品鉴定的关键步骤和高风险步骤，最好是接受分子遗传学培训的观察员。建议由两名操作员在活检、样品收集和基因检测期间目击并签署唯一的患者识别码以及胚胎/细胞编号（另见关于PGT组织的论文（参阅ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）。aCGH程序的以下步骤也需要目击过程：
在WGA程序开始时，以确保将正确体积的PCR主混合物装入每个反应管中；
-在贴标过程开始时，确保将正确体积的贴标混合物装入每个管中；
-将标记的DNA样品加载到阵列载玻片上时，以确保每个样品都与载玻片上的样品标识符匹配；
-并在记录aCGH结果时确保aCGH文件对应于正确的细胞和/或胚胎。
批内对照。
•合适的阳性对照尚不容易获得（即不平衡的单个人类卵裂球、TE细胞或其他类型的细胞来代表不平衡的人类卵裂球或TE细胞）。
•阴性对照用于确认“无模板”管中没有污染，这并不代表其余带有活检样品的反应管中没有污染。
•建议将稀释的基因组DNA用于阳性批内对照，以分别检查单个或少量细胞是否扩增成功以及反应是否成功。
•建议使用含有样本收集缓冲液、活检基质或冲洗基质的阴性对照（基于PGT中心的规程）来控制每个活检样本组的污染（即IVF实验室阴性对照）。
建议在扩增反应建立过程中至少使用一个仅含扩增混合液的阴性对照来控制污染（即遗传实验室阴性对照）。
检测前的步骤。
内部质量控制。当将aCGH用于PGT-SR时，面临的挑战是可靠地调用不平衡的染色体变异，同时避免假阳性或假阴性。
检测（小的）不平衡的染色体片段的可能性取决于所用平台的性能参数。
•建议在一系列实验中使用以下来源的DNA时，确定有效的分辨率阈值以及假阴性和假阳性结果的百分比，以及平台的特异性和敏感性：
-从具有确定的结构拷贝数变化的细胞系中分离出的单个细胞；
-以前的不平衡妊娠（如果有）；
-从先前进行的PGT-SR病例的捐赠胚胎中分离的细胞。使用经过验证的技术获得的初始PGT结果应作为参考，以确定涉及变异的特定染色体区域的假阳性/阴性检测率。
建议测试相同DNA样品的重复样品，以确定最有可能代表真实拷贝数变化的偏差比。
•DNA扩增后，应看到一条清晰的琼脂糖凝胶条带和/或DNA浓度的定量测量值至少应为20-50 ng/μl。
•建议测试每批微阵列的质量。
•建议使用杂交模板形式来记录样品追踪。
•必须对aCGH载玻片进行条形码编码，以保持样品和用于杂交的微阵列载玻片之间的关联性。
•为了QA/QC的目的，重新分析不平衡的胚胎是可接受的。
测试效率。
为了核验扩增效率，如果有使用批内对照，建议将样品和批内对照放在琼脂糖凝胶上和/或用Qubit荧光计定量。
•建议使用男性和女性参照DNA来评估杂交效率并解释结果。标记的X/Y染色体分离能在性别不匹配的样本中指示实验的成功，并且将相应的X染色体增加水平和Y染色体丢失水平用作评估常染色体非整倍性情况的参考。
•性别匹配的样本必须始终显示X或Y染色体或没有变化，并且微阵列中的任何探针都不应报告有变化。
•阴性扩增，阴性批内对照或杂交失败应显示一致的噪声谱，且不会观察到明显的模式。
•储存时间和温度会影响细胞、DNA和/或溶液的完整性，实验室应验证其规程中使用的条件是否适用于实验的目的。此外，不建议反复冻融使用含有DNA或酶的溶液。
•由于芯片微阵列表面变干而产生的杂交偏差可能导致信号丢失、荧光团标记的dUTP降解和扫描图像欠佳。
•建议严格控制aCGH载玻片的最小曝光量，并控制臭氧浓度、温度和湿度。如果臭氧含量高，建议使用实验室的碳载无纺布过滤器。
•建议避免使用清洁剂清洗冲洗仪，因为这样可能会干扰信号强度。
•建议小批量（两到三张载玻片）洗涤和扫描载玻片，以最大程度地减少载玻片和标记染料在空气中的暴露。
•至关重要的是，在最后的洗涤步骤后不久，应通过离心干燥载玻片，要避免因蒸发而干燥。
•扫描图像应具有清晰分明的特点，红色和绿色图像元素显示良好，并且颜色均匀平衡。
•为了观察到log2比率变化，测定信号与背景噪声之比（SBR）应该足够高。如果SBR较低，则可以再次冲洗载玻片并重新扫描。
•建议为每个微阵列实验计算可接受的和最佳的QC值范围。每个实验的微阵列数据的QC测定值由特定软件推断，并指示成功调用所有目标探针。QC测定值在微阵列类型和不同的扫描仪之间会有所不同。
临床前检查和报告。
临床前检查。
•夫妻两人的核型报告应从经认可/认证的细胞遗传学实验室获得。
•当应用aCGH进行结构重排检查时，不需要进行因病例而异的检查，除非携带者具有不平衡的核型。
•建议预先确保所使用的平台能识别特定重排的所有不平衡产物。检测不平衡产物的能力取决于有效分辨率和所用微阵列的覆盖范围。这需要在临床应用之前通过使用来自已非常确定的片段非整倍性的细胞系的DNA进行验证，以验证代表各个染色体特定区域的所有的（连续的）克隆/探针的存在和数量。
•对于双向相互易位，可以接受的是检测出其中四分之三的片段来可靠地识别不平衡的分离产物。
•如果从核型推断出的易位片段的大小低于所用平台的分辨率阈值，则无法进行临床PGT-SR检测。
•在用aCGH检测结构重排时，可以放弃任何其他检查。
临床前检查报告。无需提供针对具体病例的临床前湿实验室检查报告，只要在检查过程中没有任何特殊情况即可。然而，应该提供有关临床前检查的理论评估的报告。
风险评估。风险评估应涵盖：
-由于样品跟踪错误引起的风险；
-由于aCGH分析之前处理活检样品（吸管转移、清洗）时不慎所引起的风险，这可能会损害DNA完整性并导致WGA失败或不良；
-结构重排的大小不同于基于父母核型的不一致报告所预期的大小的风险，这时可能无法通过aCGH方案检测到（如果它们低于所用平台的分辨率）；
-由于实验条件欠佳而导致不确定或错误结果的风险，
-由于生物学原因导致不确定或错误结果的风险：（i）重排携带者的配子在第一次减数分裂期间的交叉互换可能会导致不平衡分离；（ii）在卵裂期或囊胚期的染色体嵌合可能会导致对实际胚胎核型的错误解读；（iii）形态不良的胚胎具有包含降解DNA的细胞的危险；
-患者的流产、死产、（存活的）不平衡后代、嵌合后代或染色体不平衡的后代的风险低于检测分辨率的风险，无论是生物学原因还是技术错误。
测试的局限性。
•易位片段的检测受到平台分辨率的限制。如果有多于四分之一的易位片段的大小低于此分辨率检测限，则不能应用基于aCGH的PGT。
•端粒附近或亚端粒附近具有断点的不平衡分离并不总能检测到，因为这些区域的探针覆盖率很低。对于每个基于aCGH的PGT-SR病例，应在临床前检查期间做好局限性调查研究。
•基于aCGH的PGT-SR分析无法区分具有正常核型或平衡核型的胚胎。
•基于aCGH的PGT-SR分析无法检测UPD。当临床相关染色体（即6、7、11、14、15、20号染色体）参与到不平衡或罗伯逊易位，涉及染色体14或15时，染色体变异携带者发生UPD的风险增加（Kotzot，2008）。UPD的产前诊断是可以接受的，但应根据个人情况进行严格评估。
•基于微阵列的PGT-SR分析对检测嵌合现象的敏感性不如NGS。
SNP微阵列
基于SNP微阵列的PGT-SR并非基于对实际染色体的检测。胚胎核型仅是从胚胎活检的DNA中检测到的单倍型推断而来。
基于SNP微阵列的PGT-SR需要进行临床前检查来对不平衡进行定相（phase）。定相（phasing）是通过使用夫妇双方和一个参考DNA进行的（建议使用平衡的参考，但使用不平衡的参考也可以接受）。如果没有可用的参考，则可以在临床周期内进行诊断，并且需要至少一个不平衡的胚胎或明确定义的断点来区分不平衡的胚胎。
在进行SNP微阵列分析之前，所有样品都必须先经过WGA。
•对于PGT-SR用于平衡重排遗传的携带者，该方法的附加价值在于，基于单倍型信息，可以将携带平衡形式重排的胚胎与正常二倍体非携带者胚胎区分开。
•根据所涉及片段的大小，感兴趣区域的异常强度比可能会也可能不会被检测到。如果可检测到，建议由对数比和B等位基因频率值来支持诊断。
有关SNP微阵列的更多建议请参阅关于单基因疾病检测的论文（ESHRE PGT-M工作组等，2020）。
实验室问题。
程序。程序可能会因所使用的平台而有很大不同。与平台无关的方面包括：（i）样品预处理； （ii）载玻片上的杂交；（iii）SNP染色和检测；（iv）数据分析。
样品预处理和杂交通常包括以下任一或所有过程：处理活检样品（PB，单个卵裂球或TE细胞）；细胞裂解和WGA；在载玻片上加载样品。可靠的SNP调用的生成至关重要，并且这些生成过程可能会因平台而异。
质量不好和/或数量不足的WGA材料以及初始材料的污染会导致基因分型数据不佳。
从微阵列读取的SNP调用后，这些原始数据被进一步计算分析并使用各种算法做生物信息学分析以优化基因分型并实现单倍型。
由于这些步骤可能会因平台而异，因此建议分别优化和验证每个步骤（包括整个湿法工艺步骤以及生物信息学分析），以凭经验确定最佳测定条件和分析设置。对于每个平台，应通过验证实验来定义SNP调用阈值和最小SNP调用速率（详见“预检查过程”部分）。
周转时间。从样品处理到数据分析的周转时间可能从24小时到几天不等，具体取决于设置和所选择的平台。建议每个实验室在内部验证应用缩短的周期是否会影响杂交效率和数据质量。
为了积累用于SNP微阵列运行的样本，可以将活检样本在短期内（数周）保存，而WGA样本可以在-20或-80℃下长期（数年内）保存。
文档。相关的实验室文档应包括：
-核型，如果有来自患者和定相参考的断点的FISH验证，最好是具有高分辨率（550-800条带）；
-关于以前任一受孕不平衡产物的报告；
--遗传咨询报告，其中可能包含有关PGT-SR的建议、检测方法的指示以及检测的优缺点；
-夫妻双方对于风险评估和检测局限说明的知情同意。
实验室基础设施，设备和材料。
基础设施。有关PGT组织的论文（请参阅ESHRE PGT学会指导委员会等，2020年）和“基于微阵列的PGT-SR”部分介绍了基础设施的一般方面。
设备。SNP微阵列平台各自的不同之处在于价格、分辨率（微阵列上SNP的数量）和化学性质。初始设置应遵循制造商的说明书，建议与制造商合作来确保已优化实验室空间以满足要求。此外，建议让具有相关专业知识的信息技术人员参与进来，以确保所有必需的要素（硬件、服务器、数据存储、互联网）均已就绪。
•活检样品的WGA和SNP微阵列分析所需的设备包括：
-II类安全柜，最好装有UV-C灯，以防止在WGA期间样品被污染；
-带加热盖的热循环仪；
-通风柜、杂交箱/培养箱、水浴、凝胶电泳设备（检验扩增是否成功）、适用于平板和反应管的涡旋混合仪；
-配备有相应激光及适合特定载玻片类型的的扫描仪，用于激发杂交的荧光团以读取和存储杂交的结果图像，并将其放置在臭氧参数低、温度调节适当、免受日光照射的扩增后室。
•DNA定量系统的应用（以测定WGA之后扩增的DNA的数量）不是必要的。
•还应在适当的条件下配备关联的服务器，并且关键步骤中使用的仪器应连接UPS。
•建议在程序的每个步骤之前，先验证设备和溶液的温度范围和/或pH值。应在各个设备的PGT中心验证特定的温度和热循环程序，并应定期维修和校准仪器以确保准确性。
•单倍型分析软件并不总是能通过商业途径获得；因此，需要保证与生物信息学家的密切合作。
材料。对于程序的不同步骤中使用到的所有试剂，应记录批号和有效期。
根据所使用的平台和制造商的不同，WGA和SNP微阵列分析所需的材料可能会有很大差异，并且可能包含以下一种或多种成分：
•细胞裂解、扩增酶和缓冲液；
•DNA片段缓冲液和酶、荧光团和修饰的dNTP，由于它们对光敏感，因此应在最小曝光量下使用；
•杂交和洗涤缓冲液；
•微阵列载玻片
工作实践控制。
识别与目击。
•建议使用带有两个特定患者标识符和胚胎/细胞编号的适当标签系统。
•对于关键步骤和高风险步骤，应由一名独立的观测者确认标签和样品识别，最好是接受过分子遗传学培训的人员。建议由两名操作员在活检、样本收集和基因检测期间目击并签署唯一的患者标识符、胚胎/细胞编号并签字（另见关于PGT组织的论文（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020））。在WGA/SNP微阵列过程的以下步骤中也需要目击过程：
-在WGA程序开始时，确保已将正确体积的反应混合母液加到每个反应管中；
-在SNP微阵列程序开始时，确保已将正确体积的样品转移到正确的反应管/平板上;
-向SNP微阵列载玻片上加DNA样品时，确保每个样品都与载玻片上的样品标号匹配（应监控和记录每个样品的载玻片编号和位置）；
-在记录SNP微阵列结果时，确保扫描的原始文件对应于正确的细胞和/或胚胎。
批内对照。建议使用阴性和阳性对照与测试样品一起测定，以检查是否发生污染或扩增失败。
•尚无合适的阳性对照（即不平衡的单个人类卵裂球、TE细胞或其他类型的细胞代表不平衡的人类卵裂球或TE细胞）。
•推荐将稀释的基因组DNA输入作为阳性批内对照，以分别检查单个/少量细胞是否成功扩增以及反应是否成功。
•阴性对照用于确认“无模板”管中没有污染，但不能担保携带活检样品的其余反应管中没有污染。
•建议至少使用一个仅带洗涤缓冲液的“无模板”管（即IVF实验室阴性对照）和一个仅带扩增混合液的阴性对照（即遗传实验室阴性对照），以排除这些基质的DNA污染。
检测前过程。
内部质量控制。QC参数定义了样品的总体质量情况。根据平台的不同，用户实验室应根据可接受的调用速率和样本噪声水平定义质量控制。当将SNP微阵列用于PGT-SR时，根据质量参数，异常染色体定位和相关片段的大小、异常强度比可能在感兴趣的区域中检测不到。如果可检测到，建议用对数比和B等位基因频率值来支持诊断。
•建议使用已知核型的细胞系中的单个细胞，或使用通过先前验证过的技术方法诊断出的含有已知缺失或重复的胚胎中的相同的WGA产物来验证方案。
•建议进行精准度评估，包括正常样本和异常样本。由于不同的染色体区域可能具有不同的SNP覆盖范围，因此异常样本系列应覆盖该检测需要检测到的结构重排范围。对于每种重排类型，建议至少使用三个阳性样本。
•DNA扩增后，应看到清晰的琼脂糖凝胶条带图和/或定量测定DNA浓度并保证足以进行进后续的检测。
•经过精准度评估检测后，建议计算程序的性能（敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值）。
•建议测试每批SNP微阵列的质量。
•建议使用杂交模板表格来记录样品追踪。
•必须对SNP微阵列载玻片进行barcode编码，以保持样品与用于杂交的SNP微阵列载玻片之间的关联性。
检测效率。
•建议在收集样品的同一反应管中执行WGA程序。
•为了查看扩增效率，建议在琼脂糖凝胶上对样品和批内对照（如果有用到）进行跑胶验证和/或用Qubit荧光计定量。
•阴性扩增，批内阴性对照或杂交失败应显示一致的噪声谱，且未观察到明显的模式。
•储存时间和温度会对细胞、DNA和/或溶液的完整性产生影响，实验室应验证其程序中使用的条件是否能满足目的。此外，不建议使用反复冻融的含有DNA或酶的溶液。
•建议为每个SNP微阵列实验计算可接受的与最佳的QC范围。QC测定值在微阵列类型和不同的扫描仪之间会有所不同。建议执行内部验证以为总体的噪声值确定一个检测特异性阈值。
临床前检查和报告。
临床前检查。建议在临床前检查期间采取以下步骤：
•建议检查与重排有关的染色体片段是否在目标SNP微阵列上被充分覆盖。
•父母亲和定相参考核型可能有助于检测和遗传咨询。
临床前检查报告。关于PGT组织的论文提供了有关临床前检查报告的管理和患者信息的一般性指南和建议（见ESHRE PGT学会指导委员会等，2020年）。对于使用SNP微阵列的PGT-SR，临床前检查报告还应包括一个对检查的总结。
建议在报告中明确说明以下内容：
•患者的病症和核型（可以使用ISCN命名法）；
•测试局限性和PGT误诊的残留风险，包含一个数字。
风险评估。风险评估应涵盖以下内容：
-样品跟踪错误造成的风险；
-在SNP微阵列分析（吸管转移、清洗）之前处理活检样品所引起的风险，操作时如稍有不慎，可能会损害DNA完整性并导致WGA失败或不佳；
-由于WGA的实验条件欠佳或较高的背景噪声而导致不确定或错误结果的风险；
-由于目标片段周围发生同源重组而导致不确定的结果的风险；
-患者产生流产、死产、（存活的）不平衡后代、嵌合后代或染色体不平衡后代的风险低于检测分辨率的风险，无论是生物学原因还是由于技术错误导致；
-偶然发现的风险。
测试的局限性。SNP微阵列单倍型需要携带目标区域重排的配偶的至少一位一级亲属，以进行定相测定。
下一代测序
NGS允许直接读取测序的DNA片段，并基于序列读取数对其进行定量。根据测序读取深度，NGS可以应用于不同的检测中，从整个染色体非整倍性到染色体中等大小的缺失或插入，以及单基因疾病的检测。与aCGH相比，基于NGS的染色体拷贝数评估可能具有以下优势：（i）通过高通量测序技术降低了DNA测序成本，并且可以在单个实验中同时测序的样品数量更多（后者要求添加唯一标签）；
（ii）分辨率的提高可能增强对缺失和重复的检测（如检测前验证中所述）；（iii）增加动态范围可增强对TE样品中染色体嵌合现象的检测；（iv）测序文库构建的潜在自动化可最大程度减少人为错误，减少动手时间并实现更高的通量和一致性。
实验室问题。
NGS程序。通过NGS程序进行测序包括五个步骤：（i）样品处理；（ii）初步质量分析；（iii）文库的准备；（iv）测序和（v）数据分析。
样品处理和测序通常包括以下任一或所有过程：活检样品（PB、单个卵裂球或TE细胞）的处理；细胞裂解；样品的barcoding（分子标签）；衔接子连接；扩增；文库准备；流动池加载；序列读取（reads）的产生。建议对DNA进行初步质量分析；初始材料的污染会导致测序数据质量不佳。
NGS平台生成的DNA序列几乎完全是自动化的，其输出包括数百万至数十亿的短序列读取。测序后产生的原始数据将通过计算分析和生物信息学知识，使用多种算法进一步处理，以将短序列读图与线性参考人类基因组序列进行比对。
由于这些过程可能会因平台而异，因此建议单独优化和验证每个步骤（包括整个湿法工艺步骤以及生物信息学分析），以凭经验确定最优检测条件和分析设置。
对于每个平台，应通过验证实验确定基因组覆盖度、平均读取深度和最小读取数（详见检测前过程部分）。
周转时间。NGS的周转时间（从DNA扩增到报告）可能因平台而异，但目前至少为12小时。预计在将来周转时间将大大减少。
为了积累用于NGS运行的样本，活检样本可以被短期（数周内）保存，WGA样本在-20或-80℃下可被长期（数年）保存。
文档。有关实验室文档应包括：
-患者的染色体核型，如果有经认可/认证的细胞遗传学实验室验证的断点，则最好具有高分辨率（550-800谱带）；通常，重排断点是根据GTG带状染色体定义的，并且由于该技术的分辨率很低，因此存在潜在的风险，即实际易位片段比预期的要小（得多），因此检测到所有结构变异的不平衡分离产物的概率要低（很多）；
-关于以前任何不平衡受孕产物的报告；
-遗传咨询报告，其中可能包含有关PGT-SR的建议、检测方法的指示以及检测的益处和局限性；
-夫妻双方对风险评估和检测局限性指标的知情同意。
实验室基础设施、设备和材料。
基础设施。有关PGT组织的论文（ESHRE PGT学会指导委员会等，2020）和“基于微阵列的PGT-SR”部分介绍了基础设施的一般方面。
设备。NGS平台在价格、容量、化学性质和读取长度等方面有所不同。NGS系统的初始设置应遵循制造商的说明书，建议与制造商合作以确保实验室空间已优化到足以满足要求。此外，建议让具有相关专业知识的信息技术人员参与进来，以确保所有必需的要素（硬件、服务器、数据存储、互联网）均已就绪。
基于NGS的PGT需要以下设备：
•DNA定量仪器：准确测定用于文库制备的起始DNA的数量至关重要。有几种选择可以对少量DNA进行高度准确的定量。其中包括Qubit高灵敏度双链DNA（HS dsDNA）荧光计，可测量dsDNA。与标准分光光度法相比，HS dsDNA荧光计可对样品中存在的DNA量进行更准确的计算。260 nm处的吸光度与280 nm处的吸光度之比用作样品纯度的指标。建议使用吸光度比值为1.8至2.0的DNA。
•热循环仪：DNA扩增和标记是文库制备过程中的必要步骤，因此需要使用热循环仪。
•移液器或移液机器人：NGS必须使用专用的多通道移液器和单通道移液器。
•建议使用多通道移液器或自动化系统，以最大程度减少程序的不同步骤中样品贴错标签或样品错误分配的风险。
•测序仪应配置到专门设计的房间，并按照制造商的说明调节光线和温度。关联的服务器也应保持在适当的条件下，关键步骤中使用的仪器应连??
